一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因 的引物、探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳青霉烯類抗生素抗菌譜廣，抗菌活性強，殺菌作用快。碳青霉烯類抗生素一直 以來是治療肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌感染最有效的抗生素。近年來碳青霉烯水解酶 的出現(xiàn)使得碳青霉烯類抗生素的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，其中最典型的就是KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶）的產(chǎn)生是目前引起腸桿菌科細菌 對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。
[0003] 隨著肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的感染率逐漸上升，臨床上采用改良的Hodge實驗 進行檢測，但是該方法的假陽性率較高，而當肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶低水平表達時又會 產(chǎn)生假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶不準確的問題，本發(fā)明實施例提 供了一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒。所述技術(shù)方案如 下：
[0005] -方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物 和探針，所述引物和探針包括：用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢 測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的 探針，其中，
[0006] 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示；
[0007] 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示；
[0008] 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所 示；
[0009] 所述探針的5'端連接有熒光基團FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探針的 3' 端連接有淬滅基團 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試 劑盒，所述試劑盒包括上述引物和探針。
[0011]具體地，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、臨界陽性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控 品、陰性質(zhì)控品和工作標準品。
[0012] 具體地，所述工作標準品包括：工作標準品1、工作標準品2、工作標準品3和工作 標準品4,其中，
[0013] 所述工作標準品1為IX 107拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0014] 所述工作標準品2為IX 106拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0015] 所述工作標準品3為IX 105拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0016] 所述工作標準品4為IX 104拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段。
[0017] 具體地，所述陽性質(zhì)控品為1. OX 106拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的 基因片段。
[0018] 具體地，所述正向引物和所述反向引物的終濃度均為0. 05-0. 9 yM，所述探針的終 濃度為 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具體地，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴增反應(yīng)體系中包括：終濃度為0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR緩沖液和終濃度為 1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
[0020] 具體地，所述核酸釋放劑包括無菌水、終濃度為0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、終濃度為0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值為8. 3的終濃度為0. 01-0. 1M 的三（羥甲基）氨基甲烷。
[0021] 具體地，所述臨界陽性質(zhì)控品為1. ox 104拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯 酶的基因片段。
[0022] 具體地，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理鹽水。
[0023] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實施例提供的用于檢測 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針，該引物和探針具有靈敏度高的特性，使得本 發(fā)明實施例提供的用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試劑盒，也具有靈敏度高的特 性，該試劑盒采用儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，其檢測結(jié)果可靠，提高了 檢測的靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段該試劑盒也可以進行有效的檢測。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例2提供的熒光擴增曲線圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實施例3提供的熒光擴增曲線圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實施例4提供的熒光擴增曲線圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實施例5提供的標準曲線的熒光擴增曲線圖；
[0029] 圖5是本發(fā)明實施例5提供的熒光擴增曲線圖；
[0030] 圖6是本發(fā)明實施例5提供的由圖4得到的標準曲線圖，圖6橫坐標為 LogStarting Quantity copy number，縱坐標為 Threshold Cycle。
[0031] 圖中：Cycles 為循環(huán)數(shù)，RFU為焚光值，Log Starting Quantity copy number為肺 炎克雷伯菌碳青霉稀酶基因起始濃度的對數(shù)值，Ct (Threshold Cycle)值為循環(huán)數(shù)；la-實 施例2中樣品1，4a-實施例2中樣品4，5a-實施例2中樣品5，6a-實施例2中樣品6，7a-實 施例2中樣品7。
【具體實施方式】
[0032] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方 式作進一步地詳細描述。以下實施例中所用試劑和探針主要購自寶生物工程（大連）有限 公司。
[0033] 實施例1. 一種用于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因核酸定量檢測的引物和探針 [0034] 本發(fā)明實施例提供了一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針， 該引物和探針包括：用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測肺炎克 雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針，其 中，
[0035] 用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示；
[0036] 用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID N0. 2所 示；
[0037] 用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID N0. 3所示；
[0038] 探針的5'端連接有熒光基團？411、冊乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探針的3' 端連接有淬滅基團TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本發(fā)明實施例中，探針 的熒光報告基團為FAM，F(xiàn)AM的激發(fā)波長為485nm，接收波長為527nm ;淬滅基團為Eclipse。 純化方式可選自：HAP、PAGE和HPLC純化方式，具體地引物和探針如下表：
[0039] 表1.肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針，其特征在于，所述引物 和探針包括：用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測肺炎克雷伯菌 碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針，其中， 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示； 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所 示； 所述用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探針的5'端連接有熒光基團FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探針 的 3' 端連接有淬滅基團 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括如權(quán)利要求1所述的引物和探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反 應(yīng)液、臨界陽性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和工作標準品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標準品包括：工作標準品1、工 作標準品2、工作標準品3和工作標準品4,其中， 所述工作標準品1為IX IO7拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標準品2為I X IO6拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標準品3為I X IO5拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標準品4為I X IO4拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性質(zhì)控品為1.0 X 10 6拷貝/mL 的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的終濃 度均為0. 05-0. 9 y M，所述探針的終濃度為0. 05-0. 9 y M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴增反應(yīng) 體系中包括：終濃度為0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR緩沖液和終濃度為1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸釋放劑包括無菌水、終濃度為 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、終濃度為0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值為8. 3的終濃度為0? 01-0.1 M的三（羥甲基）氨基甲烷。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述臨界陽性質(zhì)控品為1.0 X 10 4拷貝 AiL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理 鹽水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述引物和探針包括：用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針。所述試劑盒包括上述的引物和探針。所述引物、探針和試劑盒具有靈敏度高的特性，能夠快速檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-22
【公開號】CN104745690
【申請?zhí)枴緾N201510052461
【發(fā)明人】劉茹, 桑筱筱
【申請人】湖北永邦醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年1月30日