一種同時分析人基因組dna 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的引物組、試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的引物 組、試劑盒及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該系統(tǒng)可以應(yīng)用于個體識別和親子鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 短串聯(lián)重復(fù)序列基因座（Short Tandem Repeat，STR)是目前普遍應(yīng)用的遺傳標(biāo) 記。STR標(biāo)記與其他遺傳標(biāo)記物相比，STR基因座片段小、容易擴增，更適用于微量和降解檢 材，各基因座的擴增條件相近而能夠復(fù)合擴增，因而具有快速、高效、準(zhǔn)確、靈敏、信息量大 等優(yōu)點。尤其是在建立DNA數(shù)據(jù)庫方面，與以往RFLP等技術(shù)相比，STR復(fù)合擴增技術(shù)具有 極大的優(yōu)越性。因此美國FBI進行了大量研宄，選擇了 13個STR基因座用于建立DNA數(shù)據(jù) 庫--CODIS (Combined DNA Index System) :CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、 0135317、0163539、018351、021311、？64、1'1101、1?(?、 ￥'^，這些311?基因座通常被稱為13個 核心基因座。
[0003] 正因為STR所具備的應(yīng)用前景，法醫(yī)界以及一些公司均對其進行了大規(guī)模的開 發(fā)性研宄。90年代中后期以美國ABI (Applied Biosystems，USA)為代表的技術(shù)型公司建 立起復(fù)合擴增和熒光檢測體系，并誕生了最具代表性的是ABI公司的IdentifilerTM和 Promega(USA)公司的PowerPlex-16焚光檢測試劑盒。這兩個試劑盒均包括上述13個核心 基因座，分別為5色和4色試劑盒。
[0004] 長期的DNA檢驗實踐表明，STR基因座的遺傳多態(tài)性在種族間存在一定的差異，各 個基因座間差別也很大。在美國FBI推薦的13個核心基因座中，有部分基因座遺傳多態(tài)性 不高，或是不同人群間差異較大，并不完全適用于中國人群，給DNA檢驗技術(shù)的應(yīng)用帶來一 定的影響，因此，增加適合的檢測基因座數(shù)目，從而增加分辨率，提高檢測效率，是STR熒光 試劑盒發(fā)展的一大要求，如2012年法醫(yī)學(xué)雜志FSI :Genetics就刊文提議將13C0DIS升級 成 24 個 STR 基因座位點，除先前 13C0DIS 外，加入 D2S1338、D19S433、D1S1656、D12S391、 D2S441、D10S1248、Penta E、DYS391、SE33、D22S1045、Penta D 等 11 個基因座，外加 Amelogenin，共計25個位點。
[0005] 目前市場上主流的商品化試劑盒通常采用的是五色熒光檢測技術(shù)。但隨著檢測基 因座數(shù)需求的增多，五色熒光技術(shù)檢測基因座數(shù)的限制性凸顯，因此六色熒光檢測技術(shù)的 建立和應(yīng)用，是STR熒光檢測試劑盒的必然趨勢。
[0006] 據(jù)此，我們在目前已廣泛使用的五色熒光檢測基礎(chǔ)上，測試不同的第六色熒光，確 定其在基因分析儀上的可實現(xiàn)性，最終成功建立了國內(nèi)第一個STR六色熒光檢測系統(tǒng)；同 時對中國人群的STR基因座的遺傳多態(tài)性進行了深入的研宄，并以此為依據(jù)開發(fā)新的包含 所有升級C0DIS位點的復(fù)合擴增體系，特別是針對Amel的Y染色體丟失樣本，加入Y染色 體長臂上的2個基因座--Y indel和DYS391用以鑒別，以求在六色熒光檢測系統(tǒng)中，提 供對包括Amelogenin在內(nèi)的27個基因座的分型結(jié)果，是目前國內(nèi)累計個體識別能力和累 積非父排除率最高的試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是：提供一種同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合 擴增的引物組、試劑盒及應(yīng)用，同時通過六色熒光檢測體系檢測，來進行個體識別和親子鑒 定的STR復(fù)合檢驗系統(tǒng)。涉及檢測人基因組中具有多態(tài)性的STR遺傳標(biāo)記。本發(fā)明特別涉 及用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在一個體系中同時擴增多個短串聯(lián)重復(fù)基因座。
[0008] 技術(shù)方案：
[0009] 一種同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的引物組，包括 有用于擴增如下27個基因座的引物對：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、 Penta E、TP0X、TH01、D2S1338、CSFlP0、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21Sll、D18S51、 D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Y indel、D2S441、DYS391、SE33 及 Amelogenin〇
[0010] 上述引物對的序列以及在擴增體系中的濃度如表1所示：
[0011] 表1各基因座引物序列及濃度
【主權(quán)項】
1. 一種同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的引物組，其特征 在于，包括有用于擴增如下27個基因座的引物對：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、 DlS1656、Penta E、TP0X、TH01、D2S1338、CSFlP0、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21Sll、 D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Y indel、D2S441、DYS391、 SE33 及 Amelogenin。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的 引物組，其特征在于：所述的引物對的序列如下所示：D3S1358 SEQ ID NO. 1~2、D13S317 SEQ ID NO. 3 ~4、D7S820 SEQ ID NO. 5 ~6、D16S539 SEQ ID NO. 7 ~8、D1S1656 SEQ ID NO. 9 ~KKPenta E SEQ ID NO. 11 ~12、TP0X SEQ ID NO. 13 ~14、TH01 SEQ ID NO. 15 ~ 16、D2S1338 SEQ ID NO. 17 ~18、CSFlPO SEQ ID NO. 19 ~20、Penta D SEQ ID NO. 21 ~ 22、D10S1248 SEQ ID NO. 23 ~24、D19S433 SEQ ID NO. 25 ~26、vWA SEQ ID NO. 27 ~28、 D21S11 SEQ ID NO. 29 ~30、D18S51 SEQ ID NO. 31 ~32、D6S1043 SEQ ID NO. 33 ~34、 D8S1179 SEQ ID NO. 37 ~38、D5S818 SEQ ID NO. 39 ~40、D12S391 SEQ ID NO. 41 ~42、FGA SEQ ID NO. 43 ~44、D22S1045 SEQ ID NO. 45 ~46、Y indel SEQ ID NO. 47 ~48、D2S441 SEQIDN0.49~50、DYS391SEQIDN0.51~52、SE33SEQIDN0.53~54&Amelogenin SEQ ID NO. 35 ~36。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增 的引物組，其特征在于：所述的引物對在擴增體積中的終濃度如下所示：SEQ ID NO. 1~2， 0? 13yM、SEQ ID NO. 3 ~4,0. 15yM、SEQ ID NO. 5 ~6,0. 3yM、SEQ ID NO. 7 ~8,0. 14yM、 SEQ ID NO. 9 ~10,0? 13 yM、SEQ ID NO. 11 ~12,0? 67 yM、SEQ ID NO. 13 ~14,0? 08 yM、 SEQ ID NO. 15 ~16,0. 13 yM、SEQ ID NO. 17 ~18,0. 16 yM、SEQ ID NO. 19 ~20,0. 15 yM、 SEQ ID NO. 21 ~22,0.8 yM、SEQ ID NO. 23 ~24,0.7 yM、SEQ ID NO. 25 ~26, Iy M、 SEQ ID NO. 27 ~28,0.6 yM、SEQ ID NO. 29 ~30,0.6 yM、SEQ ID NO. 31 ~32,0.3 yM、 SEQ ID NO. 33 ~34,1 y M、SEQ ID NO. 37 ~38,0. 8 y M、SEQ ID NO. 39 ~40,0. 6 y M、SEQ ID NO. 41 ~42,0.6 yM、SEQ ID NO. 43 ~44,1.6 yM、SEQ ID NO. 45 ~46, Iy M、SEQ ID NO. 47 ~48,0.7 yM、SEQ ID NO. 49 ~50,0.7 yM、SEQ ID NO. 51 ~52,0.9 yM、SEQ ID NO. 53 ~54, 2 y M 及 SEQ ID NO. 35 ~36,0? 3 y M。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的 引物組，其特征在于：所述的每個引物對中至少有一個引物的5'端進行熒光染料標(biāo)記。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的 引物組，其特征在于：所述的引物對是經(jīng)過分組標(biāo)記的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的 引物組，其特征在于：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656 和 Penta E 為第一組； TP0X、TH01、D2S1338、CSFlP0、Penta D 和 D10S1248 為第二組；D19S433、vWA、D21Sll、D18S51 和 D6S1043 為第三組；0851179、055818、0125391、卩6六和六1^1(^611111為第四組；02251045、 Yindel、D2S441、DYS391 和 SE33 為第五組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的 引物組，其特征在于：每組進行標(biāo)記時是采用藍色熒光染料6-FAM、綠色熒光染料HEX、黃色 熒光染料TAMRA、紅色熒光染料標(biāo)記R0X、紫色熒光染料VIG中的任意一種進行染色，且每 組之間都不相同。
8. 包含有權(quán)利要求1~7任一項所述的同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo) 記復(fù)合擴增的引物組的試劑盒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒中，還包括有分子量內(nèi) 標(biāo)；所述的分子量內(nèi)標(biāo)選用橙色焚光SIZ ;所述的試劑盒由如下組成：Reaction Mix，10.0 UL;基因組DNA，0.125~5ng;引物混合物，5.0 yL;5U/ yL的熱啟動Taq酶，0.5 yL; sdH20,補足至 25.0yL;其中，所述的 Reaction Mix 為：.MgCl2 7.5mM, Tris-HCl buffer 125mM, KCl 125mM, dNTPs 7.5m M ,BSA 2mg/ml〇
10. 權(quán)利要求8所述的試劑盒在個體識別和親子鑒定中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時分析人基因組DNA 27個基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增的引物組、試劑盒及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明將27個基因座分為5組，共涉及6種顏色的熒光標(biāo)記；本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴增系統(tǒng)的靈敏度高，在DNA模板量為0.12ng的條件下，可檢出全部27個基因座；適用于血濾紙、FTA卡采集樣本的直接擴增，該系統(tǒng)可以應(yīng)用于個體識別和親子鑒定。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104745691
【申請?zhí)枴緾N201510091635
【發(fā)明人】鄭衛(wèi)國, 王艷芳, 齊麗媛, 張雷, 盧文翔, 郭育林, 葛海鵬
【申請人】無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月2日