一種轉(zhuǎn)基因玉米nk603品系的lamp檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米品系的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系的 LAMP試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因作物或基因修飾作物是通過導(dǎo)入外源基因并整合到基因組中，使某一或某 些性狀得到改良的作物。轉(zhuǎn)基因作物在提高抗性及改良品質(zhì)上起到重要的作用。但是由于 轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能產(chǎn)生新毒素和過敏原、導(dǎo)致抗性基因的基因漂移等原因，國際社會對轉(zhuǎn)基 因食品的安全性仍有相當(dāng)大的爭議。歐盟、美國、日本等國家都相繼頒布了相關(guān)法令，對轉(zhuǎn) 基因作物及其衍生食品進(jìn)行標(biāo)識管理，并對閾值作了相關(guān)規(guī)定。我國衛(wèi)生部也于2002年出 臺了《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》。該《辦法》規(guī)定：對"以轉(zhuǎn)基因動植物、微生物或者其直 接加工品為原料生產(chǎn)的食品和食品添加劑"必須進(jìn)行標(biāo)識。因此建立一套方便、快捷的轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)品檢測技術(shù)是貫徹標(biāo)識制度的重要前提。
[0003] 轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系是由美國孟山都公司（Monsanto Company)研制開發(fā)，將耐 除草劑基因CP4 EPSPS導(dǎo)入玉米中，這一基因編碼的CP4 EPSPS蛋白，可以使玉米抗草銨 膦。目前該轉(zhuǎn)基因玉米雖已經(jīng)歐盟正式批準(zhǔn)用于食品和飼料，但其安全性仍然備受關(guān)注。
[0004] 目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要是基于核酸水平的PCR檢測，包括多重 PCR(Multiplex PCR)、實(shí)時定量PCR(Real-time PCR)等，但是這些方法需要具有實(shí)時熒光 檢測功能的熱循環(huán)設(shè)備，存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長，不適合于現(xiàn)場實(shí)時檢測以及跟 蹤檢測。2000年，日本學(xué)者Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法一一環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)（l〇〇P _mediated isothermal amplification，LAMP)，該方法針對革 E1 基因的 6 個 區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，提高了檢測的特異性，同時其擴(kuò)增效率較普通PCR高，很大程度地 提高了靈敏度，LAMP技術(shù)具有簡單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已用于致病菌、病毒、寄生蟲、過 敏原、物種鑒定等檢測中。
[0005] 隨著越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)基因組分的快速檢測受到廣泛 關(guān)注，LAMP擴(kuò)增技術(shù)為恒溫?cái)U(kuò)增，可不依賴熱循環(huán)儀，普通恒溫儀器既可以進(jìn)行檢測。因此 快速簡便的LAMP已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、水稻等作物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系的LAMP檢測試劑盒及檢測方 法。
[0007] 一種轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系的LAMP檢測試劑盒，其反應(yīng)體系中包括：甜菜堿、 dNTP、Bst DNA聚合酶緩沖液、熒光染料SYTO-9、Bst DNA聚合酶、Mg2+、陽性對照、陰性對 照；其特征在于，還包含下述引物，所述引物的堿基序列如下所示：
[0008] 外引物 F3 :5' -GACCAGGTAATCTTACCTTTGT-3 '
[0009] 外引物 B3 :5，-TGAAACCGCTTTCAAGAGAA-3，
[0010] 內(nèi)引物 FIP :5' -GGCCGCGTTAACAAGCTTACTTTTTGGACTATCCCGACTCTCT-3'
[0011] 內(nèi)引物 BIP :5，-CTTGGTACCACGCGACACATTTTCTGTTATGGTTCGAGAAGAGAT-3 '
[0012] 環(huán)引物 LF :5' -TCGAGGTCATTCATATGCTTGA-3'
[0013] 環(huán)引物 LB:5' -AGTGTTTGAGTGGATCCTGTT-3'。
[0014] 優(yōu)選地，所述的反應(yīng)體系中甜菜堿濃度為0.3-1. 5mM、dNTP濃度為0.2-3. 5mM、 Mg2+濃度為2-18mM。
[0015] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系中所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1-8 : 1 ;環(huán)引物和 外引物濃度之比為1-2 : 1。
[0016] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系含有0. 2 y M外引物、1. 6 y M內(nèi)引物、0. 4 y M環(huán)引物。
[0017] 優(yōu)選地，Bst DNA聚合酶含量為4-10U，更優(yōu)選地，Bst DNA聚合酶含量為8U。
[0018] 優(yōu)選地，其特征在于所述的陽性對照為轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系的基因組DNA。
[0019] 優(yōu)選地，所述的陽性對照為含有NK603品系耐除草劑基因CP4EPSPS基因的重組質(zhì) 粒。
[0020] 所述的陽性對照重組質(zhì)粒制備方法如下所述：提取轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系基因組 DNA，利用引物F3/B3進(jìn)行PCR，擴(kuò)增并回收CP4EPSPS基因并克隆到載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，DNA測序確認(rèn)序列正確的質(zhì)粒。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用LAMP檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系的檢測方 法，包括以下主要步驟：
[0022] (1)提取待檢測樣品基因組DNA，以樣品基因組DNA為模板；
[0023] (2)按照檢測樣品數(shù)目，按照每樣品25微升反應(yīng)體系準(zhǔn)備LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液：取 2XLAMP reaction mixture 12.5 yL，其中包括 40mmol/L Tris-HCl pH 8.8, 20mmol/L KCl，16mmol/L MgS04, 20mmol/L (NH4) 2S04,0. 2 % Tween-20,0. 8mol/L Betaine, 2. 8mmol/L of dNTPs ;加入lOymol/L的外引物F3溶液0? 5yL、10ymol/L的外引物B3溶液0? 5yL ; 加入20 y mol/L的內(nèi)引物FIP溶液2 y L、20 y mol/L的內(nèi)引物BIP溶液2 y L ;加入5 y mol/ L的環(huán)引物L(fēng)F溶液2 y L、5 y mol/L的環(huán)引物L(fēng)B溶液2 y L ;加入熒光染料SYTO-9 0. 5 y L、 8U/ y L Bst DNA 聚合酶 1 y L、混勻；
[0024] (3)加入待檢測樣本DNA模板2 y L，混勻反應(yīng)體系；
[0025] (4)等溫?cái)U(kuò)增：在PCR管內(nèi)壁加20 y L密封液；63°C恒溫反應(yīng)45min，反應(yīng)結(jié)束后， 與陽性對照顯示熒光相比較；
[0026] (5)結(jié)果判讀：反應(yīng)結(jié)束后采用實(shí)時熒光圖來判斷擴(kuò)增結(jié)果，反應(yīng)中使用的染料 為熒光染料SYT0-9。所述的判定結(jié)果是根據(jù)熒光染料SYT0-9形成的擴(kuò)增曲線作為檢出轉(zhuǎn) 基因玉米品系NK603的結(jié)論，反之，結(jié)果為未檢出轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603。
[0027] 本發(fā)明提供了一種閉管熒光檢測體系，本發(fā)明根據(jù)LAMP技術(shù)原理，將該方法與實(shí) 時熒光技術(shù)相結(jié)合，在LAMP反應(yīng)體系中，加入熒光染料，擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增得到的DNA與熒 光染料相結(jié)合，不需要電泳，在肉眼或熒光檢測儀上即可方便觀察擴(kuò)增結(jié)果，該實(shí)時熒光 LAMP快速檢測方法，適合在基層檢測單位及