具有細(xì)胞內(nèi)穿透能力的誘導(dǎo)rna干擾的核酸分子及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型結(jié)構(gòu)的具有細(xì)胞內(nèi)穿透能力的RNAi誘導(dǎo)核酸分子及其用 途，更具體地說(shuō)，涉及一種具有優(yōu)異的靶基因抑制效率且無(wú)需另外的細(xì)胞載體而具有細(xì)胞 內(nèi)穿透能力的新型結(jié)構(gòu)的核酸分子以及利用該核酸分子的靶基因的表達(dá)抑制方法，所述核 酸分子具有誘導(dǎo)RNAi的雙鏈核酸分子中含有的至少一個(gè)核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)或者二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)取代且結(jié)合有親油性化合 物（lipophilic compound)的結(jié)構(gòu)。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾（RNA interference :RNAi)是非常特異的能夠有效抑制基因表達(dá)的機(jī) 制，該機(jī)制在細(xì)胞等中導(dǎo)入雙鏈RNA(dsRNA)而誘導(dǎo)靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的 表達(dá)，其中，所述雙鏈RNA(dsRNA)由具有與靶基因的mRNA同源序列的正義鏈和具有與靶基 因的mRNA互補(bǔ)序列的反義鏈構(gòu)成。
[0003] 誘導(dǎo)這樣的RNA干擾的siRNA是堿基序列能夠特異性地抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的短 長(zhǎng)度（19~21bp)的雙鏈RNA，因?yàn)槠渚哂懈咝市院桶袠?biāo)特異性，因此目前作為難以治 療的癌、病毒的感染以及遺傳病等各種疾病的治療劑備受關(guān)注。在利用siRNA的有效的 治療劑開發(fā)方面，還存在穩(wěn)定性、沉默效率（silencing efficiency)、免疫反應(yīng)、脫祀效應(yīng) (off-target effects)等各種需解決的問題，其中體內(nèi)（in vivo)的有效傳遞（delivery) 成為最難以解決的問題而被指出。siRNA因?yàn)榱姿峁羌埽╬hosphate backbone)結(jié)構(gòu)而 帶有高的負(fù)電荷（negative charge)，由此無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜，且因?yàn)槠湫〉某叽缍谘?(blood)中快速地被去除，由此難以傳遞充分量的siRNA以在實(shí)際靶標(biāo)部位上實(shí)施RNAi誘 導(dǎo)。
[0004]目前，針對(duì)體外釋藥（in vitro delivery)開發(fā)出很多利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 (cationic lipids)和陽(yáng)離子聚合物（cationic polymers)的高效傳遞（delivery)方 法(Sioud M， Sorensen DR Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice. Biochem Biophys Res Commun 2003 ;312 :1220_1225)。但是，大部分情況 下，在體內(nèi)（in vivo)無(wú)法如體外（in vitro)那樣高效率地傳遞siRNA，由于與生物體 內(nèi)存在的各種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用（interaction)，因此存在siRNA的傳遞效率變?nèi)醯?問題（Bolcato-Bellemin AL，Bonnet ME，Creusat G，et al. Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007;104:16050-16055)。另外，根據(jù)傳遞載體 (delivery vehicle)的組成，與發(fā)生疾病的部位無(wú)關(guān)地會(huì)在肝或肺等特定臟器中高濃度地 蓄積，因此還存在誘發(fā)毒性的問題。
[0005] 一方面，已知結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tisssue frowth factor，CTGF/ CCN2)作為基質(zhì)細(xì)胞蛋白（metricellular protein)的一種，其在細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、迀移 (migration)、ECM生成（ECM production)、附著（adhesion)等方面起到重要的作用。在各 種臟器中誘導(dǎo)纖維化（fibrosis)而損壞臟器功能的慢性纖維化疾?。╟hronic fibrotic disorders)的情況下，確認(rèn)到引起纖維化疾病（fibrotic disorder)的組織中CTGF被過(guò) 表達(dá)，在皮膚的情況下已較好地研宄出CTGF和纖維化（fibrosis)的關(guān)系。正常皮膚中 CTGF表達(dá)被抑制成正常水平（basal level)，但在發(fā)生創(chuàng)傷的情況下，則觀察到CTGF的 表達(dá)暫時(shí)性地增加。與此相對(duì)，瘢痕瘤（keloid)或硬化癥（localized sclerosis)的情 況下，在創(chuàng)傷治愈之后CTFG的過(guò)表達(dá)仍然持續(xù)，利用反義（antisense)等抑制CTGF的表 達(dá)時(shí)纖維化（fibrosis)以及瘢痕瘤（keloid)的生成被抑制，由此確認(rèn)到CTGF在纖維化 (fibrosis)以及肥厚性瘢痕的生成起到重要的作用（Sisco M，Kryger ZB，0'Shaughnessy KD，et al. Antisense inhibition of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2) mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo. Wound R印air Regen 2008;16:661-673.D0I:WRR416[pii])。在病理學(xué)方面，報(bào)告有全長(zhǎng) CTGF 分 子與存在結(jié)締組織細(xì)胞的過(guò)度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域中 還記載有：CTGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、增殖以及血管新生相關(guān)的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。作為與這些 狀態(tài)相關(guān)的疾病以及障礙，可例舉：皮膚以及主要器官的纖維癥、癌，以及系統(tǒng)性硬化病、血 管生成、動(dòng)脈粥樣硬化癥、糖尿性腎病以及腎性高血壓等相關(guān)疾病、障礙。另外，還報(bào)告有： CTGF對(duì)創(chuàng)傷治愈、結(jié)締組織恢復(fù)、骨以及軟骨恢復(fù)等方面也有用。對(duì)于上述內(nèi)容，已公開有 CTGF作為骨、組織或者軟骨生成的誘導(dǎo)因子在骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎或者骨軟骨炎、關(guān)節(jié) 炎、骨骼疾病、肥厚性瘢痕、燒傷、血管性肥大癥或者聲音（sound)治愈等方面起到作用（例 如，參考文獻(xiàn)（美國(guó)專利第5,837,258號(hào)））。
[0006] 為此，本發(fā)明人等為了提供可在體外（in vitro)以及體內(nèi)（in vivo)實(shí)施有效 傳遞的具有朝向細(xì)胞內(nèi)的穿透能力的新型結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)RNAi的核酸分子而進(jìn)行悉心研宄的 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)RNAi的雙鏈核酸分子中含有的至少一種核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)取代并結(jié)合（conjugation)親油性化合物（lipophilic compound) 時(shí)，該核酸即使在體內(nèi)（in vivo)也無(wú)需另外的細(xì)胞載體而具有優(yōu)異的靶基因抑制效率并 同時(shí)具有優(yōu)異的細(xì)胞內(nèi)穿透能力，從而完成了本發(fā)明。
[0007] 該【背景技術(shù)】部分中記載的上述內(nèi)容僅用于加深理解本發(fā)明的背景，對(duì)于本發(fā)明所 屬的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可能未包含構(gòu)成已知現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)容。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010](專利文獻(xiàn)1)美國(guó)專利第5,837, 258號(hào)
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] (非專利文獻(xiàn)1)SioudM，SorensenDRCationicliposome-mediateddelivery ofsiRNAsinadultmice.BiochemBiophysResCommun2003 ；312 ：122〇-1225
[0013] (非專利文獻(xiàn)2)Bolcato-BelleminAL，BonnetME，CreusatG，etal.Sticky overhangsenhancesiRNA-mediatedgenesilencing.ProceedingsoftheNational AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007 ；104 ：16050-16055
[0014] (非專利文獻(xiàn) 3) Sisco M，Kryger ZB，0' Shaughnessy KD，et al. Antisense inhibition of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2)mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo. Wound Repair Regen 2008；16 ：661-673. DOI ：WRR416[pii]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于，提供一種可在體外（in vitro)以及體內(nèi)（in vivo)實(shí)施有效 傳遞且具有朝向細(xì)胞內(nèi)的穿透能力的新型結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)RNAi的核酸分子及其用途。
[0016] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種RNAi誘導(dǎo)用核酸分子，其具有細(xì)胞內(nèi)穿透 能力（cell-penetrating ability)，其特征在于，在由包含與革E核酸（target nucleic acid)互補(bǔ)區(qū)域的第一鏈和與所述第一鏈形成互補(bǔ)結(jié)合的第二鏈構(gòu)成的誘導(dǎo)RNAi的 雙鏈核酸分子中，所述核酸分子中含有的至少一個(gè)核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)或者二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)取代并結(jié)合有親油性化合 物（lipophilic compound)〇
[0017] 本發(fā)明還提供一種基因表達(dá)抑制用組合物，其含有所述核酸分子。
[0018] 本發(fā)明還提供一種細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)抑制方法，其包括細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入所述核酸分子 的步驟。
[0019] 本發(fā)明還提供一種用于治療或預(yù)防CTGF相關(guān)疾病或者障礙的藥物組合物，其以 編碼結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tisssue frowth factor，CTGF)的mRNA作為革E核酸 并含有所述核酸分子。
[0020] 本發(fā)明還提供一種CT