in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。宿主細(xì)胞在符合所用特定宿主細(xì) 胞要求，特別是pH值、溫度、鹽濃度、曝氣、抗生素、維生素、微量元素等方面中的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì) 里培養(yǎng)。
[0185] 本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明，其包含核酸分子或載體或用核酸分子或載 體轉(zhuǎn)化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞表達(dá)了根據(jù)本發(fā)明的并能將〇-磷酸-L-高絲 氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的蛋白質(zhì)。原理上，宿主細(xì)胞可以是任意可能的宿主細(xì) 胞，例如動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌 細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如埃希氏桿菌、棒狀 桿菌、梭菌、芽孢桿菌或不動(dòng)桿菌屬，更優(yōu)選大腸桿菌、棒狀桿菌、谷氨酸棒桿、枯草芽孢桿 菌）或不動(dòng)桿菌維藍(lán)蒂屬。
[0186] 在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，例如酵母、假絲酵母、阿舒囊霉 菌、克魯維酵母、畢赤醇母、耶氏酵母、接合酵母、曲霉菌、德巴利酵母或球擬酵母屬，更優(yōu)選 釀酒酵母、釀酒馬克西姆斯（Saccharomyces maximus)、麥芽糖假絲酵母、來自棉桃阿舒氏 囊霉、克魯維酵母、畢赤酵母、樹干畢赤酵母、解脂假絲酵母、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、漢遜德巴利 酵母或圓酵母種。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
[0187] 如上所述，本發(fā)明還涉及用于制備核酸分子的方法，所述核酸分子編碼能將0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的蛋白質(zhì)。所述方法包括以下步驟：
[0188] (i)在編碼胱硫醚y合酶（EC 2. 5. 1. 48)的核酸中產(chǎn)生突變從而制備突變的胱硫 醚Y合酶；
[0189] (ii)在宿主細(xì)胞中并在允許選擇編碼能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶 轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的核酸分子的培養(yǎng)條件下，表達(dá)獲自步驟（i)的突變的核酸分 子；
[0190] (iii)確定這些表達(dá)能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨 酸的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和
[0191] (iv)從步驟（iii)確定的宿主細(xì)胞中獲得編碼能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫 醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的突變的胱硫醚 Y合酶的核酸分子。
[0192] 本發(fā)明還涉及用于制備能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫 氨酸的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括表達(dá)獲自根據(jù)本發(fā)明的上述方法獲得的核酸分子并再 生編碼的蛋白質(zhì)的步驟。
[0193] 術(shù)語"胱硫醚Y合酶（EC2. 5. 1. 48)"指任意具有胱硫醚Y合酶的酶活性的酶。 胱硫醚Y合酶是催化以下反應(yīng)的酶
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于制備L-高絲氨酸的方法，其中O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇根據(jù)以下反 應(yīng)方案通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸和H 3PO4: 〇-磷酸-L-高絲氨酸+CH3-SH〈 = >L-甲硫氨酸+H3P04。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述通過酶的轉(zhuǎn)化通過使用依賴OHPS的甲硫氨酸 合酶實(shí)現(xiàn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述依賴OHPS的甲硫氨酸合酶是通過突變衍 生自胱硫醚Y合酶（EC2. 5. 1. 48)的蛋白質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶，其具有的氨基酸序列顯示與下列序列至少70%的序列等 同性 (i) 天然存在的胱硫醚Y合酶的氨基酸序列；或 (ii) SEQ ID NO: 1或2中所示的氨基酸序列；或 (iii) SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列；或 (iv) SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列；或 (V)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中依賴OHPS的甲硫氨酸合酶是選自組成 如下群組的蛋白質(zhì)： (a) 包括在SEQ ID NO 6至29中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b) 具有與SEQ ID NO 6至29中任一個(gè)至少60%的序列等同性并具有將0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸和H3PO 4的酶活性的蛋白質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法在體外進(jìn)行。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法通過使用產(chǎn)生如權(quán)利 要求2至5任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)的微生物進(jìn)行。
8. 具有將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸和H #04的酶活性的蛋白 質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，其通過突變衍生自胱硫醚Y合酶（EC2. 5. 1. 48)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的蛋白質(zhì)，其具有的氨基酸序列顯示與以下序列至少 70%的序列等同性 (i) 天然存在的胱硫醚Y合酶的氨基酸序列；或 (ii) SEQ ID NO: 1或2中所示的氨基酸序列；或 (iii) SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列；或 (iv) SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列；或 (V)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的蛋白質(zhì)，具有將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為 L-甲硫氨酸和恥04的酶活性，其中所述蛋白質(zhì)選自組成如下的群組： (a) 包括在SEQ ID NO 6至29中任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b) 具有與SEQ ID NO 6至29中任一個(gè)至少60%的序列等同性并具有將0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸和H3PO 4的酶活性的蛋白質(zhì)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的蛋白質(zhì)，其為具有與SEQ ID NO 6至29中任一個(gè)至少80% 的序列等同性的序列并具有將〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸和H3PO 4 的酶活性的蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其 (i)通過取代或刪除SEQ ID NO :3中至少一個(gè)氨基酸殘基衍生自具有SEQ ID NO :3所 示的氨基酸序列的胱硫醚Y合酶，所述氨基酸殘基選自組成如下的群組： (a) 脯氨酸10 ; (b) 天冬酰胺11 ; (c) 谷氨酰胺15 ; (d) 異亮氨酸27 ; (e) 丙氨酸30 ; (f) 亮氨酸45 ; (g) 絲氨酸47 ; (h) 纈氨酸60 ; (i) 丙氨酸68 ; (j) 苯丙氨酸150 ; (k) 蘇氨酸178 ; (l) 天冬氨酸183 ; (m) 異亮氨酸185 ; (n) 蘇氨酸220 ; (〇)甲硫氨酸232 ; (P)纈氨酸245 ; (q) 丙氨酸257 ; (r) 天冬酰胺259 ; (s) 苯丙氨酸261 ; (t) 苯丙氨酸275 ; (u) 異亮氨酸287 ; (V)組氨酸289 ; (w)酪氨酸324 ; (X)甘氨酸326 ; (y) 脯氨酸356 ; (z) 蘇氨酸371 ; (aa)纈氨酸396 ; (bb) 脯氨酸405 ; (cc)天冬氨酸431 ; (dd)異亮氨酸436 ; (ee)異亮氨酸457 ; (ff)天冬氨酸459 ; (gg)脯氨酸470 ; (hh)谷氨酸472 ; (ii)丙氨酸506 ; (jj)異亮氨酸507。 或 (ii) 通過取代或刪除至少一個(gè)對(duì)應(yīng)以上列出的SEQ ID NO :3中（a)至（jj)中任一個(gè) 的氨基酸殘基衍生自胱硫醚Y合酶，其氨基酸序列顯示與SEQ ID NO :3中顯示的氨基酸序 列至少60%的序列等同性 或 (iii) 通過刪除一個(gè)或更多個(gè)對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :3中所示的氨基酸序列的氨基酸1至103 的N-末端氨基酸衍生自蛋白質(zhì)（i)或（ii)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其還顯示了將0-磷酸-L-高絲氨酸和 硫化物轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高半胱氨酸和H3PO 4的酶活性。
15. 編碼權(quán)利要求8至14任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)具有將0-磷 酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸和H 3PO4的酶活性。
16. 包含權(quán)利要求15所述的核酸分子的載體。
17. 包含權(quán)利要求15所述的核酸分子或權(quán)利要求16所述的載體的宿主細(xì)胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求8至14任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求8至14任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞用于將 〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸和H 3POj^用途。
20. 用于制備核酸分子的方法，所述核酸分子編碼能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇 轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸的蛋白質(zhì)。所述方法包括以下步驟： (i) 在編碼胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1.48)的核酸中產(chǎn)生突變從而制備突變的胱硫醚 y合酶； (ii) 在宿主細(xì)胞中并在允許選擇編碼能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化 為L(zhǎng)-甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的核酸分子的培養(yǎng)條件下，表達(dá)獲自步驟（i)的突變的核酸分子； (iii) 確定這些表達(dá)能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高絲氨酸的 蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和 (iv) 從步驟（iii)確定的宿主細(xì)胞獲得編碼能將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過 酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸的突變的胱硫醚Y合酶的核酸分子。
21. 用于制備S-腺苷甲硫氨酸的方法，其包括權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的用于制備 L-甲硫氨酸的方法并還包括將L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸的步驟。
22. 用于制備半胱氨酸的方法，其包括權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的用于制備L-甲硫 氨酸的方法并還包括將L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的步驟。
23. 用于制備谷胱甘肽的方法，其包括權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的用于制備L-甲硫 氨酸的方法并還包括將L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽的步驟。
24. 用于制備2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的方法，其包括權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的 用于制備L-甲硫氨酸的方法并還包括將L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的 步驟。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于制備L-甲硫氨酸的方法，其中O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸和H3PO4。所述轉(zhuǎn)化通過稱為依賴O-磷酸-L-高絲氨酸(OHPS)的甲硫氨酸合酶實(shí)現(xiàn)。還描述了依賴O-磷酸-L-高絲氨酸(OHPS)的甲硫氨酸合酶，即能將O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸和H3PO4的蛋白質(zhì)以及已經(jīng)過基因修飾從而能從O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇制備L-高絲氨酸的微生物。還描述了用于篩選催化O-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇至L-甲硫氨酸和H3PO4的轉(zhuǎn)化的酶的方法。
【IPC分類】C12N9-10, C12P11-00, C12P21-02, C12N15-10, C12P13-12, C12P19-40
【公開號(hào)】CN104755625
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380055160
【發(fā)明人】繆里·梅爾卡姆, 多米尼克·路易斯, 卡琳·加拉爾東, 多米尼克·托馬斯, 菲力浦·馬利爾
【申請(qǐng)人】安迪蘇法國(guó)聯(lián)合股份有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2013年10月25日
【公告號(hào)】EP2912185A2, US20150275247, WO2014064244A2, WO2014064244A3