酰肼化pH敏感型聚合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學技術(shù)領(lǐng)域，具體是酰肼化pH敏感型聚合物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的糖基化修飾是最廣泛也是最重要的一種翻譯后修飾過程。人體50%以上的蛋白質(zhì)都帶有糖基化修飾。糖基化幾乎參與了所有重要的生命過程，例如受精、發(fā)育、免疫應(yīng)答、細胞間識別及通訊等。同時也有研宄表明，多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程也都伴隨著蛋白質(zhì)的糖基化修飾或者蛋白質(zhì)糖基化修飾的改變。因此，系統(tǒng)的定性定量鑒定、分析糖蛋白及其方法學的發(fā)展對于闡明糖基化修飾在各個生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及對于臨床診斷標志物的發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要。但是由于復(fù)雜樣本中蛋白濃度有相當廣泛的動態(tài)范圍，動態(tài)范圍大約10-12個數(shù)量級，而絕大多數(shù)糖蛋白都是低豐度表達的蛋白，使得糖蛋白的鑒定效率大大降低；其次，白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等高豐度蛋白的存在大大的抑制了低豐度蛋白的檢測；此外，糖蛋白上的糖鏈具有高度的微觀不均一性及多樣性，因此質(zhì)譜無法測定糖蛋白精確的化學結(jié)構(gòu)及質(zhì)量數(shù)，分散的質(zhì)量數(shù)也導致檢測靈敏度的降低。為了實現(xiàn)在復(fù)雜體系中規(guī)模化的糖蛋白分析，當前國際上的主要研宄策略都是在質(zhì)譜檢測前，先對糖蛋白或者糖肽進行富集、分離，有效地降低樣品的復(fù)雜程度，從而提高糖蛋白的鑒定效率?，F(xiàn)在針對糖蛋白或者糖肽常用的富集、分離手段主要有以下三種:凝集素親和法；酰肼、硼酸化學富集法；親水相互作用色譜法。其中酰肼化學法由于被富集糖蛋白或者糖肽與酰肼發(fā)生共價連接，因為可以有效提高富集效率，降低非糖蛋白或者非糖肽對其檢測的干擾。然而，傳統(tǒng)的酰肼材料都是將酰肼官能團固定于特定的載體之上，例如瓊脂糖、磁珠或者硅球，利用其表面的酰肼官能團實現(xiàn)對溶液中糖蛋白或者糖肽的富集。因此，由于反應(yīng)位阻的存在，大大降低了其和糖蛋白或者糖肽中醛基反應(yīng)的速率，直接降低了其對糖蛋白或者糖肽的富集效率。
[0003]pH敏感聚合物由于含有弱酸性或者弱堿性單體，隨著體系pH值、離子強度等因素的改變，這些離子發(fā)生電離，造成高分子內(nèi)外離子濃度的改變，并導致大分子鏈段間氫鍵的解離，引起不連續(xù)的溶脹體積的變化或溶解度的改變。在低PH條件下，聚酸類pH敏感聚合物中的羧基接受質(zhì)子，此時靜電斥力逐漸消失，最終導致高聚鏈的聚結(jié)；在中性或者較高PH條件下釋放質(zhì)子，分子間較強的靜電斥力使得聚合物呈聚電解質(zhì)狀態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種提高反應(yīng)速率和糖肽富集效率的酰肼化pH敏感型聚合物及其制備方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
一種酰肼化PH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引發(fā)劑、水合肼、有機相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:10-10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:10-10:1，所述引發(fā)劑的投料量為0.02%-2%w/v,所述有機相和水相的體積比為 1:10-10:1。
[0006]作為本發(fā)明進一步的方案:所述酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引發(fā)劑、水合肼、有機相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為8:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為5:1，所述引發(fā)劑的投料量為0.2%w/v，所述有機相和水相的體積比為1:1。
[0007]作為本發(fā)明進一步的方案:所述引發(fā)劑為過硫酸鉀、過硫酸銨、偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的一種或兩種以上。
[0008]作為本發(fā)明進一步的方案:所述有機相為甲醇、乙腈及乙醇中的一種或兩種以上。
[0009]作為本發(fā)明進一步的方案:所述酰肼化pH敏感型聚合物在pH低于4的水相體系中沉淀析出，在pH高于4的水相體系中則完全溶解。
[0010]作為本發(fā)明進一步的方案:所述酰肼化pH敏感型聚合物用于對糖肽進行富集，利用酰肼化PH敏感型聚合物的pH敏感性將富集得到的糖肽和非糖肽進行分離，使用肽N-糖苷酶F將所富集的糖肽釋放之后，再使用質(zhì)譜進行鑒定
所述酰肼化PH敏感型聚合物的制備方法，具體步驟如下:
(1)取料:按照使用標準稱取各原料；
(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反應(yīng):將有機相和水混合得到混合溶液，并對該混合溶液中充入惰性氣體除氧1.8-2.2h，將丙烯酸、丙烯酸甲酯和引發(fā)劑加入至上述除氧溶液中，繼續(xù)除氧25-35min后撤去惰性氣體保護，加熱到55_65°C ；
(3)聚合物的酰肼化處理:將上述過夜后的反應(yīng)體系放置到其溫度為室溫，向反應(yīng)體系中加入水合肼，室溫攪拌過夜，將反應(yīng)體系中的有機相減壓蒸餾之后將所得的酰肼化pH敏感聚合物在3K透析袋中透析2-3d，直至未反應(yīng)的單體和水合肼被完全去除，最后，將其冷凍干燥得到聚合物。
[0011]作為本發(fā)明再進一步的方案:所述惰性氣體為氮氣或氬氣。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明是由丙烯酸和丙酸甲酯共聚之后再經(jīng)過水合肼肼化獲得，其中酰肼的含量明顯高于商品化酰肼材料中酰肼的含量，酰肼化PH敏感聚合物中的酰肼官能團和氧化糖肽中醛基的反應(yīng)為共價結(jié)合，可以提供糖肽富集的特異性，酰肼化PH敏感聚合物在pH高于4的體系中為溶解狀態(tài)，可以實現(xiàn)其官能團酰肼和糖肽的醛基反應(yīng)的均相性，從而提高反應(yīng)速率及糖肽富集效率。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明的制備反應(yīng)流程示意圖。
[0014]圖2為本發(fā)明和現(xiàn)有商品化固相酰肼材料與糖蛋白的反應(yīng)速率比較示意圖。
[0015]圖3為未經(jīng)富集的牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段直接使用PNGaseF酶切去除糖鏈后的MALD1-TOF-MS質(zhì)譜圖。
[0016]圖4為牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段經(jīng)本發(fā)明富集后使用PNGaseF去除糖鏈后的 MALD1-TOF-MS 質(zhì)譜圖。
[0017]圖5為牛血清白蛋白和牛胎球蛋白以100:1的質(zhì)量比例混合之后的胰蛋白酶酶解肽段直接使用PNGaseF酶切去除糖鏈后的MALD1-TOF-MS質(zhì)譜圖。
[0018]圖6為牛血清白蛋白和牛胎球蛋白以100:1的質(zhì)量比例混合之后經(jīng)本發(fā)明富集牛胎球蛋白的糖肽使用PNGaseF去除糖鏈后的MALD1-TOF-MS質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合【具體實施方式】對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
[0020]請參閱圖1-6，一種酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、弓丨發(fā)劑、水合肼、有機相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:10-10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:10-10:1，所述引發(fā)劑的投料量為0.02%-2%w/v，所述有機相和水相的體積比為1:10-10:1。
[0021]實施例1
本發(fā)明實施例中，一種酰肼化PH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、過硫酸鉀、水合肼、甲醇和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:2，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為1:10，所述過硫酸鉀的投料量為0.02%w/v,所述甲醇和水相的體積比為1:3。
[0022]所述酰肼化pH敏感型聚合物的制備方法，具體步驟如下:
(1)取料:按照使用標準稱取各原料；
(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反應(yīng):將甲醇和水混合得到混合溶液，并對該混合溶液中充入氮氣除氧1.8h，將丙烯酸、丙烯酸甲酯和過硫酸鉀加入至上述除氧溶液中，繼續(xù)除氧25min后撤去氮氣保護，加熱到55°C ；
(3)聚合物的酰肼化處理:將上述過夜后的反應(yīng)體系放置到其溫度為室溫，向反應(yīng)體系中加入水合肼，室溫攪拌過夜，將反應(yīng)體系中的有機相減壓蒸餾之后將所得的酰肼化pH敏感聚合物在3K透析袋中透析2d，直至未反應(yīng)的單體和水合肼被完全去除，最后，將其冷凍干燥得到聚合物。
[0023]實施例2
一種酰肼化PH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、過硫酸銨、水合肼、乙腈和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為8:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為5:1，所述過硫酸錢的投料量為0.2%w/v,所述乙腈和水相的體積比為1:1。
[0024]所述酰肼化pH敏感型聚合物的制備方法，具體步驟如下:
(1)取料:按照使用標準稱取各原料；
(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反應(yīng):將乙腈和水混合得到混合溶液，并對該混合溶液中充入氬氣除氧2h，將丙烯酸、丙烯酸甲酯和過硫酸銨加入至上述除氧溶液中，繼續(xù)除氧30min后撤去氬氣保護，加熱到60°C ；
(3)聚合物的酰肼化處理:將上述過夜后的反應(yīng)體系放置到其溫度為室溫，向反應(yīng)體系中加入水合肼，室溫攪拌過夜，將反應(yīng)體系中的有機相減壓蒸餾之后將所得的酰肼化pH敏感聚合物在3K透析袋中透析2d，直至未反應(yīng)的單體和水合肼被完全去除，最后，將其冷凍干燥得到聚合物。
[0025]實施例3
一種酰肼化PH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、偶氮二異丁腈、水合肼、乙醇和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩爾比為8:1，所述偶氮二異丁腈的投料量為l%w/v，所述乙醇和水相的體積比為1:5。
[0026]所述酰肼化pH敏感型聚合物的制備方法，具體步驟如下:
(1)取料:按照使用標準稱取各原料；
(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反應(yīng):將乙醇和水混合得到混合溶液，并對該混合溶液中充入氮氣除氧2.2h，將丙烯酸、丙烯酸甲酯和偶氮二異丁腈加入至上述除氧溶液中，繼續(xù)除氧35min后撤去氮氣保護，加熱到65°C ；