統(tǒng)，利用溫敏自殺質(zhì)粒pSET4s作為載體對豬鏈球 菌7型菌株SBP_bac_5編碼的基因進行敲除而得到的菌株，破壞了 SBP_bac_5蛋白的表達。 本發(fā)明的主要優(yōu)點是：
[0023] 1、本發(fā)明所用的材料是S. suis血清7型WC-ss7株，是本試驗室研宄人員從發(fā)病 豬組織里分離到的S. suis血清7型流行株，是現(xiàn)地流行菌株的代表，因此，今后以該菌株構 建的SBP_bac_5基因缺失株為研宄對象更具有針對性。
[0024] 2、本發(fā)明得到的豬鏈球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株比親本株的毒力弱，比 國際標準7型和2型菌株的毒力弱，可作為科研工作者使用的標準豬鏈球菌7型試驗用弱 毒菌株。
[0025] 3、本發(fā)明提供所述的基因缺失重組菌，可用于改造和制備預防豬鏈球菌疫苗。因 不含任何抗性標記，完全符合我國疫苗生產(chǎn)安全。用重組菌制成疫苗，免疫CD1小鼠，實驗 結(jié)果表明：該豬鏈球菌重組菌疫苗能有效誘導機體產(chǎn)生特異性的體液免疫應答，使免疫小 鼠獲得抗S. suis攻擊的保護，并可有效阻止細菌在體內(nèi)的增值。本發(fā)明得到的工程菌為豬 鏈球菌疫苗的研制提供了重要依據(jù)。
[0026] 保藏信息：
[0027] 一、SSASBP_bac_5 :
[0028] 分類命名：豬鏈球菌 Streptococcus suis ;
[0029] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0030] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物研宄所；
[0031] 保藏編號：CGMCC No. 10076 ;
[0032] 保藏日期：2014年11月28日。
[0033] 二、WC-ss7 株：
[0034] 分類命名：豬鏈球菌 Streptococcus suis ;
[0035] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0036] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物研宄所；
[0037] 保藏編號：CGMCC No. 3343 ;
[0038] 保藏日期：2009年10月19日。
【附圖說明】
[0039] 圖1為pSET4s載體圖譜；
[0040] 圖2為SBP_bac_5上下游同源臂、融合PCR產(chǎn)物，圖中1 :SBP_bac_5上游同源臂； 2 :SBP_bac_5 下游同源臂；3 :融合 PCR 產(chǎn)物；M :DL-2000DNA Maker ;
[0041] 圖 3 為重組質(zhì)粒 pMD18T-SBP_bac_5 的構建和鑒定，圖中 M :DL-2000DNAMaker ;; 1 :pMD18T-SBP_bac_5 雙酶切鑒定；
[0042] 圖 4 為重組質(zhì)粒 pSET4s_SBP_bac_5 的構建和鑒定，圖中 1 :DL-2000DNAMaker ;2， 3 :pSET4s-SBP_bac_5 雙酶切鑒定；4 :DL-5000DNAMaker;
[0043] 圖 5 為突變株SSASBP_bac_5 的PCR鑒定結(jié)果，圖中M:DL-2000DNAMaker; 1 : 引物⑶H-F/R引物鑒定；2 :SBP_bac_5K0Pl/6引物鑒定；3 :SPCl/2引物鑒定；4 :SBP_ bac_5K0P3/4引物鑒定；
[0044] 圖 6 為WC-ss7 株和SSASBP_bac_5 株的S.suis7 型鑒定，圖中M:DL-2000DNA Maker;1 :親本株的S.suis7 鑒定；2:SSASBP_bac_5 突變株S.suis7 鑒定；
[0045] 圖7為疫苗免疫后的抗體檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0047] 1、本發(fā)明中所涉及的材料：
[0048] 1. 1菌株和質(zhì)粒（表1)
[0049] 表1所用菌株與質(zhì)粒
【主權項】
1. 一種豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株，其特征在于所述缺失株為不含抗性標記的 SSASBP_bac_5,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為： CGMCCNo. 10076。
2. -種權利要求1所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株的構建方法，其特征在于所 述方法步驟如下： 將含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂基因DNA片斷的pSET4s質(zhì)粒導入所述的 豬鏈球菌血清7型菌株，經(jīng)同源重組而實現(xiàn)的；所述的DNA片斷從上游至下游依次是SBP_ bac_5上游同源臂、SBP_bac_5下游同源臂，與所述的豬鏈球菌7型菌株的SBP_bac_5蛋白 編碼基因的上游序列和下游序列發(fā)生同源重組，得到的SBP_bac_5基因缺失株SSASBP_ bac_5〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株的構建方法，其特征在于所 述SBP_bac_5蛋白編碼基因的序列如SEQN0. 1所示。
4. 根據(jù)權利要求2所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株的構建方法，其特征在于所 述擴增上游同源臂序列的引物序列如下所示： SBP_bac_5K0Pl：GCCGTCGACAAAATGAGAAAATGATGA； SBP_bac_5K0P2:TACACCTTTATCTTTACCTTTCACATCA。
5. 根據(jù)權利要求2所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株的構建方法，其特征在于所 述擴增下游同源臂序列的引物序列如下所示： SBP_bac_5K0P5:GTGAAAGGTAAAGATAAAGGTGTAGTGGCA； SBP_bac_5K0P6 ：TTAGGATCCGATTCCCCTACAATTGCC〇
6. -種權利要求1所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株在試驗中作為標準的豬鏈球 菌7型菌株的應用。
7. -種權利要求1所述的豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株在制備預防豬鏈球菌疫苗中 的應用。
8. -種豬鏈球菌疫苗，其特征在于所述疫苗的主要活性成分為權利要求1所述豬鏈球 困SBP_bac_5基因缺失株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬鏈球菌SBP_bac_5基因缺失株及其構建方法與應用。所述缺失株為不含抗性標記的SS△SBP_bac_5，保藏編號為：CGMCC No.10076。本發(fā)明是采用RecA同源重組系統(tǒng)，利用溫敏自殺質(zhì)粒pSET4s作為載體對豬鏈球菌7型菌株SBP_bac_5編碼的基因進行敲除而得到的菌株，破壞了SBP_bac_5蛋白的表達。本發(fā)明得到的S.suis 7型SS△SBP_bac_5株比親本株的毒力弱，對動物安全。用重組菌制成疫苗，免疫CD1小鼠，實驗結(jié)果表明：該豬鏈球菌重組菌疫苗能有效誘導機體產(chǎn)生特異性的體液免疫應答，使免疫小鼠獲得抗S.suis攻擊的保護，并可有效阻止細菌在體內(nèi)的增值。本發(fā)明得到的工程菌為豬鏈球菌疫苗的研制提供了重要依據(jù)。CGMCC No.334320091019 CGMCC No.1007620141128
【IPC分類】A61K39-09, C12N15-74, C12R1-46, A61P31-04, C12N1-21, C12N15-31
【公開號】CN104762244
【申請?zhí)枴緾N201510058245
【發(fā)明人】蔡雪輝, 王淑杰, 劉永剛
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年2月4日