一種高產(chǎn)異淀粉酶的基因工程菌及其發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)異淀粉酶的基因工程菌及其發(fā)酵工藝，屬于基因工程和發(fā)酵 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 異淀粉酶（EC 3.2. 1.68)是淀粉脫支酶的一種，它可以水解糖原、支鏈淀粉和 0-極限糊精中a_l，6-糖苷鍵，對a-極限糊精具有部分水解作用，但不能水解普魯蘭多 糖。異淀粉酶在淀粉加工工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以與糖化酶、淀粉酶、CGT酶、 4_ a -葡聚糖轉(zhuǎn)移酶等淀粉酶復(fù)配生產(chǎn)葡萄糖、麥芽糖、環(huán)糊精、抗性淀粉等產(chǎn)品，縮短反應(yīng) 時間，提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，降低其它糖化用酶制劑的使用量，從而達(dá)到增加產(chǎn)量、提高設(shè)備 利用率、降低生產(chǎn)成本的目的。盡管異淀粉酶在工業(yè)上的應(yīng)用范圍越來越廣，但是，迄今為 止這仍然只有來源于假單胞菌Pseudomonas amyloderamosa的異淀粉酶實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0003] 我國關(guān)于異淀粉酶的研宄起步于20世紀(jì)90年代，開展工作不多。目前為止，發(fā) 表的文獻(xiàn)只有10余篇，主要集中于菌株篩選、誘變改良、酶分離純化以及酶學(xué)定性。其中， 王武等首先在1993年篩選到1株產(chǎn)異淀粉酶的短桿菌BI25164,經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化胞外酶活力 達(dá)到520U/mL，該酶最適溫度為50°C，最適pH5. 0。此后10年左右鮮有異淀粉酶的文獻(xiàn)報(bào) 道，直到2003年以后，國內(nèi)學(xué)者又分別篩選到產(chǎn)異淀粉酶的Bacillus、Thermus等微生物， 并開展了菌株的誘變改良和發(fā)酵優(yōu)化等工作。之前本研宄室段緒果以T. fusca基因組DNA 為模板，通過PCR克隆得到了異淀粉酶編碼基因，構(gòu)建得到了產(chǎn)重組異淀粉酶的大腸桿菌， 并優(yōu)化了重組異淀粉酶搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶條件，重組菌搖瓶發(fā)酵36h后胞內(nèi)酶活力水平達(dá)到 879. 2U/mL ;2013年江南大學(xué)李由然篩選到1株產(chǎn)異淀粉酶的細(xì)菌，并對Bacillus lentus CICM304異淀粉酶基因進(jìn)行了克隆、鑒定和大腸桿菌中的功能性表達(dá)，重組菌細(xì)胞破碎液 上清中酶活力為17. 6±0. 5U/mL，該酶最適溫度為70°C，最適pH6. 0 ;同時，李由然將來源于 Bacillus lentus JNU3的異淀粉酶基因進(jìn)行了克隆，在Pichia pastoris中實(shí)現(xiàn)了重組表 達(dá)，并在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，分批發(fā)酵條件下，72h后酶活力最高達(dá)到318U/mL。 雖然國內(nèi)在異淀粉酶研宄上雖然取得了一定的進(jìn)展，但是還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，市場上的 商業(yè)化產(chǎn)品主要為進(jìn)口酶制劑。
[0004] 大腸桿菌菌株生長快、蛋白表達(dá)量高，是重組蛋白表達(dá)最常用的宿主。然而在之前 的報(bào)道中，異淀粉酶在大腸桿菌中的產(chǎn)量依然較低，且大多為包涵體。雖然E. coli MDS42也 曾被用來作為宿主菌，但是已有研宄用E. coli MDS42來生產(chǎn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)其表 達(dá)量相比母本菌株E. coli MG1655并未提高，說明E. coli MDS42重組菌表達(dá)外源蛋白時， 可能會對菌株生長或異源蛋白的表達(dá)分泌存在某些不確定的影響。
[0005] 本發(fā)明首次把E. coli MDS42作為異淀粉酶的表達(dá)宿主，構(gòu)建了一株高產(chǎn)異淀粉酶 的基因工程菌，其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)1566U/mL，發(fā)酵罐發(fā)酵最高酶活力可達(dá)16434U/mL，降 低了異淀粉酶生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高產(chǎn)異淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程 菌是以E.coli MDS42(Scarab Genomics公司，美國）為宿主，表達(dá)來源于嗜熱裂孢菌 Thermobifida fusca 的異淀粉酶。
[0007] 所述異淀粉酶的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 所述基因工程菌是以pSX2 (Scarab Genomics公司，美國）為載體構(gòu)建得到的。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述的基因工程菌的構(gòu)建方法是：將核苷酸序列 為SEQIDNO.2的異淀粉酶基因連接到表達(dá)載體pSX2上，然后在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli MDS42中，篩選正確的轉(zhuǎn)化子，即得到基因工程菌E. coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異淀粉酶的方法，所述 方法是在發(fā)酵罐中，采用一次誘導(dǎo)或者多次誘導(dǎo)的策略發(fā)酵生產(chǎn)異淀粉酶。
[0011] 所述一次誘導(dǎo)策略，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：⑴分批發(fā)酵階段：將 種子液以7-9 %接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度35-38 °C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2， 當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1. 7g/L-4g/L時加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶；（2)補(bǔ)料發(fā)酵階段：待溶氧上升至 80-100%，進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度36-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,誘導(dǎo)19-27h。
[0012] 所述一次誘導(dǎo)策略，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，包括：（1)分批發(fā)酵階段：將 種子液以7-9%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2;(2) 補(bǔ)料發(fā)酵階段：待溶氧上升至80-100 %，進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度30-38°C、溶氧20-30 %、 pH 6. 8-7. 2 ; (3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到20-35g/L時，加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，控 制溫度 30-38°C、溶氧 20-30%、pH 6. 8-7. 2,誘導(dǎo) 8-23h。
[0013] 所述方法是采用二次誘導(dǎo)策略，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：（1)分批發(fā) 酵階段：將種子液以7-9%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2 ; (2)補(bǔ)料發(fā)酵階段：待溶氧上升至80-100%，進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度30-38°C、溶 氧20-30%4116.8-7.2;(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段 ：當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到20-35§/1、57-83§/1，分 別加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，控制溫度30-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,誘導(dǎo)8-23h。
[0014] 所述方法是采用三次誘導(dǎo)策略，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：（1)將種子液 以7-9%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,當(dāng)菌體細(xì) 胞濃度達(dá)到1. 7g/L-4g/L時加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶一次；（2)待溶氧上升至80-100 %，進(jìn)行補(bǔ) 料培養(yǎng)，控制溫度30-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2 ;(3)當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到20-35g/L、 57-83g/L，分別加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，控制溫度36-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,從第二 次加入誘導(dǎo)劑開始算起，誘導(dǎo)8-20h。
[0015] 所述發(fā)酵方法中的誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)溫度為36-38°C。
[0016] 所述發(fā)酵方法中的誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為 0. 01-0. 05mM。
[0017] 所述發(fā)酵方法中的誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度 0. 05mlL
[0018] 所述補(bǔ)料培養(yǎng)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是采用指數(shù)流加的方式流加補(bǔ)料培 養(yǎng)基。
[0019] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：（1)將種子液以8%接種量接入 發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溶氧30%、溫度37°C、pH 7. 0 ; (2)待溶氧上升至80-100%，以指數(shù)流加的 方式補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基；⑶當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到23. 0g/L、69. Og/L時，分別加入IPTG至IPTG終 濃度為〇. 〇5mM，于37°C下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，溶氧維持在30%、pH控制在6. 8-7. 0。
[0020] 本發(fā)明所述誘導(dǎo)時間，無特殊說明的，是指從第一次加入誘導(dǎo)劑開始算起。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌E. coli MDS42 (Tfu_1891/pSX2)，具有高產(chǎn)異淀粉酶 的性質(zhì)，用于發(fā)酵罐生產(chǎn)，最高酶活力可達(dá)16434U/mL，能夠解決現(xiàn)有發(fā)酵工藝中酶活力較 低、生產(chǎn)成本高的問題，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)；
[0023] (2)本發(fā)明對基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)條件進(jìn)行了研宄，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度為30_38°C時 采用一次誘導(dǎo)或者多次誘導(dǎo)的策略發(fā)酵生產(chǎn)都能得到產(chǎn)量高的異淀粉酶。尤其是誘導(dǎo)溫度 為36-38°C時，在20-35g/L細(xì)胞濃度是誘導(dǎo)或者聯(lián)合其他誘導(dǎo)方式，誘導(dǎo)8h以上就能取得 8000U/mL以上的酶活力。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :50D重組菌發(fā)酵破壁上清（搖瓶）SDS-PAGE電泳圖；
[0025] 圖2 :不同誘導(dǎo)溫度下，重組菌3. 6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線；圖中實(shí)心圖標(biāo)代表酶活 力，空心圖標(biāo)代表蛋白含量；
[0026] 圖3:重組菌3. 6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線（早期誘導(dǎo)）；圖中實(shí)心圖標(biāo)代表酶活力， 空心圖標(biāo)代表蛋白含量；
[0027] 圖4:重組菌3. 6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線（二次誘導(dǎo)）；圖中實(shí)心圖標(biāo)代表酶活力， 空心圖標(biāo)代表蛋白含量；
[0028] 圖5:重組菌3. 6L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶曲線（三次誘導(dǎo)）；圖中實(shí)心圖標(biāo)代表酶活力， 空心圖標(biāo)代表蛋白含量。
【具體實(shí)施方式】[0029] 培養(yǎng)基：
[0030] (1)LB固體培養(yǎng)基的組成為：分子級蛋白胨9-llg/L，分子級酵母粉4-6g/L，NaCl 9-1 lg/L，瓊脂粉 1.5-2%。
[0031] (2)LB液體培養(yǎng)基的組成為：分子級蛋白胨9-llg/L，分子級酵母粉4-6g/L，NaCl 9-llg/L，pH 6. 8-7. 2。
[0032] (3)TB發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：甘油4-6