一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞分離技術(shù)，涉及一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1986年Rosenberg等人首先報道了從小鼠實體瘤中分離到的淋巴細胞，稱之為“腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL) ”，是主要存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的T細胞為主的一個異質(zhì)性淋巴細胞群體，大多聚集在腫瘤周圍或其間質(zhì)呈套狀圍繞癌巢。進一步研宄發(fā)現(xiàn)，這種細胞在體外經(jīng)白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖，且具有較強的特異性殺傷腫瘤細胞的作用，其抗腫瘤作用比淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokineactivated killer cell，LAK)高50-100倍。例如有研宄發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤患者的TIL只對自體瘤細胞產(chǎn)生殺傷活性，而對自身細胞正常。
[0003]TIL細胞表型具有異質(zhì)性。一般來說，新鮮制備的原位TIL中絕大多數(shù)為T細胞。不同腫瘤來源的TIL細胞中，⑶4+T細胞和⑶8+T細胞的比例有顯著差異。除黑色素瘤、頭頸部腫瘤外，其他腫瘤中以CD8+T細胞為主。新鮮分離的TIL中CD25+細胞百分率較低，隨著體外加IL-2培養(yǎng)時間的延長，CD25+細胞百分率逐漸升高。NK細胞的標記(CD16、CD56)在TIL體外加IL-2培養(yǎng)過程中有先增高后降低的趨勢。因此，TIL在多種腫瘤(如腎癌和黑色素瘤)中具有抗自身腫瘤的特異性，可望為今后更有效地進行腫瘤的生物治療甚至預(yù)防提供強有力的依據(jù)和新的途徑。
[0004]目前分離TIL多數(shù)采用機械法或酶消化法，不僅花費大量人力物力，而且降低了分離后TIL的細胞活性。如何有效地分離TIL是急需解決的一個技術(shù)問題，為進一步研宄腫瘤免疫微環(huán)境及腫瘤的生物治療提供一個有力的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。
[0006]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0007]提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法，包括如下步驟:
[0008](I)以PBS緩沖液洗滌腫瘤組織塊后，置于培養(yǎng)皿中，加入5?10體積倍的胰酶消化液浸泡3小時；
[0009](2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5mm3的顆粒狀后，置培養(yǎng)皿在37°C水浴搖床中，將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育I?2小時，使腫瘤組織塊充分消化打散；收集細胞懸液并過200目金屬濾網(wǎng)，分離收集單個細胞至50ml離心管中；用胰酶消化液洗滌培養(yǎng)皿2次，將所有液體轉(zhuǎn)移至該50ml離心管中；
[0010](3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后，在50g離心機上離心處理2分鐘；棄底部沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至另一 50ml離心管中，在400g離心機上離心處理5分鐘，棄上清，加入3ml胰酶消化液重懸；
[0011](4)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入密度梯度離心液，進行密度梯度離心；然后收集云霧層細胞，轉(zhuǎn)移至另一玻璃管中，加入3ml胰酶消化液重懸；
[0012]加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質(zhì)量比為1:1?2，密度梯度離心過程中控制條件為500gX20分鐘，加速9減速4，溫度10C ；
[0013](5)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入IX紅細胞裂解液2ml，孵育5分鐘后加入2ml PBS緩沖液終止孵育；在400g離心機上離心5分鐘，棄上清；以PBS緩沖液洗滌細胞2次后，用含10wt%小牛血清的PBS緩沖液重懸；該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞；
[0014]所述胰酶消化液是以Hanks’平衡液為溶劑，溶液中包括0.05wt%的collagenasetype IV 和 0.0Olwt% 的 DNase I，每 200ml Hanks’ 平衡液加入 0.1llg CaCl2ο
[0015]本發(fā)明中所得腫瘤浸潤淋巴細胞的鑒定，是采用流式細胞術(shù)分離法來檢測細胞膜表面抗體，該方法具有如下步驟:
[0016](I)利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色，顯微鏡下進行細胞計數(shù)及活性測定。
[0017](2)取出IX 16個細胞于試管中(要求活細胞數(shù)>90-95% )，加入熒光標記的抗體，混勻，4°C孵育30分鐘。用PBS洗滌2次，1500rpm/min,離心3分鐘，棄上清。加300ulPBS液(PH = 7.4)，流式細胞儀進行檢測鑒定。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0019]在本發(fā)明中，酶消化結(jié)合機械法雙重高效分離腫瘤浸潤淋巴細胞，與機械法或酶消化法相比，本發(fā)明獲得腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高且簡便易行。因此，能為進一步研宄TIL在腫瘤中的作用提供強有力的保障。
[0020]通過胰酶消化、機械分離與淋巴細胞分離液相結(jié)合的方法從腫瘤組織中分離出腫瘤浸潤淋巴細胞。本發(fā)明為臨床研宄腫瘤免疫微環(huán)境提供了不同類別、不同亞型的淋巴細胞，為探討腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的免疫調(diào)節(jié)機理及在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用提供了便利的技術(shù)流程。其分離的腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高達90%以上，便于應(yīng)用推廣到各種實體瘤的淋巴細胞分離中，簡單易行。該方法分離所得的腫瘤浸潤淋巴細胞在體外經(jīng)白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖，具有特異高效的抗腫瘤活性，為臨床治療腫瘤提供強有力的依據(jù)和新的途徑。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容:
[0022]本發(fā)明的腫瘤組織塊來源于臨床上手術(shù)過程中切除的腫瘤組織樣本，屬醫(yī)療遺棄廢物，臨床手術(shù)過程并非本發(fā)明涉及內(nèi)容。
[0023]挑選腫瘤組織時，應(yīng)確認腫瘤的部位、范圍，注意與周圍組織及壞死組織的鑒別。腫瘤組織離體后在最短時間內(nèi)切取樣本(< 30min)，將腫瘤組織切成多塊直徑為0.5cm左右的組織塊，裝入滅菌凍存管中放入液氮轉(zhuǎn)移罐長期保存。
[0024]本發(fā)明中所用到的各種試劑均為市購產(chǎn)品進行配置獲得，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠熟練掌握。具體說明如下:
[0025]PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液)，其質(zhì)量濃度為10%，市購。
[0026]collagenase type IV，即膠原酶 IV，市購，Invitrogen 公司生產(chǎn)。
[0027]DNase I，即脫氧核糖核酸酶I，市購，Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。
[0028]Hanks’平衡液，即HBSS，市購，GENMED公司生產(chǎn)。
[0029]密度梯度離心液，即人淋巴細胞分離液，市購，Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。
[0030]具體實施例1
[0031]1、腫瘤浸潤淋巴細胞的分離
[0032](I)以PBS緩沖液洗滌肝癌腫瘤組織塊后，置于培養(yǎng)皿中，加入5體積倍的胰酶消化液浸泡3小時；
[0033](2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5mm3的顆粒狀后，置培養(yǎng)皿在37°C水浴搖床中，將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育I小時，使腫瘤組織塊充分消化打散；收集細胞懸液并過200目金屬濾網(wǎng)，分離收集單個細胞至50ml離心管中；用胰酶消化液洗滌培養(yǎng)皿2次，將所有液體轉(zhuǎn)移至該50ml離心管中；
[0034](3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后，在50g離心機上離心處理2分鐘；棄底部沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至另一 50ml離心管中，在400g離心機上離心處理5分鐘，棄上清，加入3ml胰酶消化液重懸；
[0035](4)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入密度梯度離心液，進行密度梯度離心；然后收集云霧層細胞，轉(zhuǎn)移至另一玻璃管中，加入3ml胰酶消化液重懸；
[0036]加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質(zhì)量比為1:1，密度梯度離心過程中控制條件為500gX20分鐘，加速9減速4，溫度10°C ；
[0037](5)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入IX紅細胞裂解液2ml，孵育5分鐘后加入2ml PBS緩沖液終止孵育；在400g離心機上離心5分鐘，棄上清；以PBS緩沖液洗滌細胞2次后，用含10wt%小牛血清的PBS緩沖液重懸；該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞；
[0038]所述胰酶消化液是以Hanks’平衡液為溶劑，溶液中包括0.05wt%的collagenasetype IV 和 0.0Olwt% 的 DNase I，每 200ml Hanks’ 平衡液加入 0.1llg CaCl20
[0039]2、腫瘤浸潤淋巴細胞的鑒定
[0040](I)利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色，顯微鏡下進行細胞計數(shù)及活性測定。
[0041](2)取出IX 16個細胞于試管中(要求活細胞數(shù)>90-95% )，加入熒光標記的抗體，混勻，4°C孵育30分鐘。用PBS洗滌2次，1500rpm/min,離心3分鐘，棄上清。加300ulPBS液(PH = 7.4)，流式細胞儀進行檢測鑒定。
[0042]具體實施例2
[0043]與實施例1相比，本實施例中:分離對象為肺癌腫瘤組織塊；步驟(I)中胰酶消化液的加入量為10體積倍；步驟(2)中水浴搖床孵育時間為2個小時；步驟(4)中加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質(zhì)量比為1:2 ;其余內(nèi)容均與實施例1相同。
[0044]具體實施例3
[0045]與實施例1相比，本實施例中:分離對象為胃癌腫瘤組織塊；步驟(I)中胰酶消化液的加入量為7體積倍；步驟(2)中水浴搖床孵育時間為1.5個小時；步驟(4)中加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質(zhì)量比為1:1.5 ;其余內(nèi)容均與實施例1相同。
【主權(quán)項】
1.一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以PBS緩沖液洗滌腫瘤組織塊后，置于培養(yǎng)皿中，加入5?10體積倍的胰酶消化液浸泡3小時； (2)將浸泡處理后的腫瘤組織塊修剪成0.5_3的顆粒狀后，置培養(yǎng)皿在37°C水浴搖床中，將腫瘤組織與胰酶消化液一并孵育I?2小時，使腫瘤組織塊充分消化打散；收集細胞懸液并過200目金屬濾網(wǎng)，分離收集單個細胞至50ml離心管中；用胰酶消化液洗滌培養(yǎng)皿2次，將所有液體轉(zhuǎn)移至該50ml離心管中； (3)將前一步驟的50ml離心管放在冰上靜置10分鐘后，在50g離心機上離心處理2分鐘；棄底部沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至另一 50ml離心管中，在400g離心機上離心處理5分鐘，棄上清，加入3ml胰酶消化液重懸； (4)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入密度梯度離心液，進行密度梯度離心；然后收集云霧層細胞，轉(zhuǎn)移至另一玻璃管中，加入3ml胰酶消化液重懸； 加入的密度梯度離心液與細胞懸液的質(zhì)量比為1:1?2，密度梯度離心過程中控制條件為500gX20分鐘，加速9減速4，溫度10°C ； (5)向前一步驟經(jīng)重懸的離心管中加入IX紅細胞裂解液2ml，孵育5分鐘后加入2mlPBS緩沖液終止孵育；在400g離心機上離心5分鐘，棄上清；以PBS緩沖液洗滌細胞2次后，用含10被％小牛血清的PBS緩沖液重懸；該離心管中溶解的細胞即為腫瘤浸潤淋巴細胞； 所述胰酶消化液是以Hanks’平衡液為溶劑，溶液中包括0.05wt %的collagenasetype IV 和 0.0Olwt% 的 DNase I，每 200ml Hanks’ 平衡液加入 0.1llg CaCl20
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞分離技術(shù)，旨在提供一種腫瘤浸潤淋巴細胞的分離方法。該方法是將腫瘤組織塊加入至胰酶消化液浸泡、孵育，使腫瘤組織塊充分消化打散；分離、收集單個細胞經(jīng)胰酶消化液重懸后進行多次密度梯度離心，再以紅細胞裂解液孵育、離心，用含小牛血清的PBS緩沖液重懸；得到溶解的腫瘤浸潤淋巴細胞。在本發(fā)明中，酶消化結(jié)合機械法雙重高效分離腫瘤浸潤淋巴細胞，與機械法或酶消化法相比，本發(fā)明獲得腫瘤浸潤淋巴細胞存活率高且簡便易行。該方法分離所得的腫瘤浸潤淋巴細胞在體外經(jīng)白細胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖，具有特異高效的抗腫瘤活性，為臨床治療腫瘤提供強有力的依據(jù)和新的途徑。
【IPC分類】C12N5-0783
【公開號】CN104762261
【申請?zhí)枴緾N201510124216
【發(fā)明人】吳健, 曹林平, 陳康杰, 丁超峰
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月20日