與小麥抗旱相關的基因TaUreG及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物基因工程技術領域，具體地說是一種與小麥抗旱相關基因TaUreG及其應用。
【背景技術】
[0002]目前，全球性氣候變暖導致土壤干旱程度越來越嚴重，這對糧食生產構成直接威脅。小麥是世界上最主要的糧食作物之一，也是我國第二大糧食作物。植物在應對干旱脅迫時會產生一系列的保護機制，研宄小麥抗旱的分子機制，培養(yǎng)抗旱小麥新品種是提高小麥產量的一個主要途徑，對于保障國家糧食安全和水資源安全具有重要意義。
[0003]植物在干旱脅迫下產生一系列的基礎反應，包括生長和代謝水平的抑制、基因表達水平的變化、體內激素水平的變化、誘導和抑制信號轉導途徑的產生、可溶性滲透保護劑的積累、活性氧簇(ROS)水平升高引起的質膜氧化等。干旱信號主要通過脫落酸(ABA)依賴的以及ABA不依賴的DREB轉錄因子介導的信號轉導途徑調節(jié)下游基因的表達(Yoshida etal.ABA—dependent and ABA—independent signaling in response to osmotic stressin plants.2014)。研宄表明，植物在應對干旱脅迫時會產生一系列的保護機制；干旱脅迫能誘導許多植物基因的表達，有些基因的表達產物可直接增強脅迫耐性，有些可以感應和轉導脅迫信號調控基因表達。近年來，隨著基因組學和分子生物學的發(fā)展，中外學者從小麥中克隆了一批抗旱相關的基因，如2011年Liu et al.報道的Express1n of a wheat MYBgene in transgenic tobacco enhances resistance to Ralstonia solanacearum, andto drought and salt stresses ；2012 年 Niu et al.報道的 Wheat WRKY genes TaVRKY2and TaWRKY19 regulate ab1tic stress tolerance in transgenic Arabidopsisplants ;2012年Qin et al.報道的 Over—express1n of TaMYB33 encoding a novel wheatMYB transcript1n factor increases salt and drought tolerance in Arabidopsis ；2012 年 Tang et al.公開的 Molecular characterizat1n of novel TaNAC genes inwheat and overexpress1n of TaNAC2a confers drought tolerance in tobacco ;這些均為篩選抗旱小麥品種、提高在干旱環(huán)境下小麥種植產量奠定了堅實的基礎。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種與小麥抗旱相關基因及其應用。
[0005]一種與小麥抗旱相關的基因其具有SEQ ID NO:1所示的cDNA核苷酸序列或SEQ ID NO: 2所示的gDNA核苷酸序列。
[0006]本發(fā)明所述gDNA包含7個外顯子和6個內含子。
[0007]一種與小麥抗旱相關的基因該基因的編碼蛋白如SEQ ID NO: 3所示。
[0008]本發(fā)明克隆所述基因前上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:
4所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0009]本發(fā)明所述基因位于小麥IA染色體上。
[0010]本發(fā)明提供的基因來源于小麥科農9204，根據(jù)序列結構特征，命名為TaUreG，哀cDNA序列全長945 bp，包含一個長為855 bp的開放閱讀框，編碼284個氨基酸；gDAN序列全長2546 bp，由7個外顯子和6個內含子組成。從5’端開始，外顯子的長度依次為77 bp、204 bp、61 bp、202 bp、122 bp、105 bp、84 bp，內含子的長度依次為86 bp、600 bp、336 bp、345 bp、129 bp、105 bp，基因結構見圖1。
[0011]本發(fā)明公開的抗旱相關的基因繩過實時熒光PCR檢測分析時，其上游引物
的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示、下游引物的核苷酸序列如SEQID NO: 9所示；內參上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示、內參下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，其擴增體系為:SYBR ? Premix ExTaq II (2X ) 10 μ I,Forward Primer (10 μM) 0.8 μ I,Reverse Primer (10 μM) 0.8μ I, ROX Reference Dye II (50X )0.4 yl，cDNA 模板 2 μ LddH2O 6 μ I ;共計 20 μ I ；其PCR反應程序:95°C預變性30 s ;95°C變性5 s，60°C退火并延伸34 S，40個循環(huán)。
[0012]本發(fā)明所用科農9204為審定品種，于2002年通過河北省農作物品種審定委員會審定；2003年通過全國品種審定，品種審定編號為國審麥2003037。
[0013]由于本發(fā)明公開的基因具有抗旱性，故可將所述核苷酸序列如SEQ ID NO:I或其編碼蛋白質如SEQ ID N0.3所示的基因轉入小麥組織，從而培育成耐旱性小麥。
[0014]本發(fā)明應用了植物基因工程技術，首次從小麥中克隆了與小麥抗旱相關的基因TaUreG,通過實時熒光定量PCR檢測，其結果表明，所述基因勺表達受到干旱脅迫的調節(jié)，能夠在小麥適應干旱脅迫的早期就起到重要作用；而且所述基因勺表達同樣受ABA和H2O2的調節(jié)，說明是通過ABA依賴的信號轉導途徑參與了小麥對干旱脅迫的響應，并且參與了干旱脅迫引起的ROS水平升高的信號轉導通路；TaUre慘與檢抗旱機制的挖掘為該基因在小麥抗旱育種中的利用提供了更為可靠的證據(jù)。由此表明，含有基因的小麥植株具有較強的抗旱能力，與小麥抗旱相關的基因在選育抗旱小麥品種中可以得到應用；尤其是可以將所述核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的基因
轉入小麥組織培育出具有高抗旱性的轉基因小麥。
【附圖說明】
[0015]圖1為基因結構圖。方框代表外顯子，線條代表內含子。ATG和TAG分別為起始密碼子和終止密碼子。
[0016]圖2為利用中國春缺體-四體系對進行染色體定位的結果。CS表示中國春；M表示marker ；以TaActin (可擴增A，B，D組)為內參證明DNA的完整性。
[0017]圖3為實時熒光定量PCR對TaUreG^ ABA處理不同時間下表達特征的分析結果。以TaActin為內參。
[0018]圖4為實時熒光定量PCR對在H2O2處理不同時間下表達特征的分析結果。以TaActin為內參。
[0019]圖5為實時熒光定量PCR對TaUr碟PEG-6000人工模擬干旱處理不同時間下表達特征的分析結果。以TaActin為內參。
【具體實施方式】
[0020]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
[0021 ] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0022]實施例1小麥抗旱相關基因勺克隆
1、小麥郵]cDNA序列的電子克隆
(1)以NCBI提交的水稻OsUreG(HM369059)基因序列為探針，搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫，將得到的序列用DNAMAN軟件拼接，對開放閱讀框(ORF)進行預測，以獲取完整的小麥TaUreGcDNA序列；
(2)根據(jù)得到的全長cDNA序列用Primer5軟件設計并篩選出一對特異引物TaUreG-Fl和分別用于小麥TaUreG cDNA和gDNA基因克隆。其上、下游引物分別為:
上游引物 TaUreG-FlS -CCTTCCACTTCCAAGTCTGG-3’ (SEQ ID NO:4)
下游引物 TaUreG-RlS -CATACGTGAACACATGCCCG-3’ (SEQ ID NO:5)。
[0023]2、利用Trizol (Invitrogen)提取總RNA，具體步驟如下:
(I)液氮研磨50-100 mg小麥葉片，研碎后轉移到含I ml Trizol試劑的EP管中，充分混勻，室溫靜置5 min;(2)加入0.2 ml氯仿，充分混勻，室溫靜置2_3 min ;在4°C下，12000X g離心15 min ； (3)把上層無色的水相轉移到一個潔凈的1.5 ml EP管中，加入0.5 ml異丙醇，混勾后室溫放置10 min ;在4°C下，12000 X g離心10 min ; (4)去上清，將沉淀用I ml 75%乙醇清洗，在4°C下，7500 X g離心5 min，之后將沉淀風干；(5)將沉淀溶于適量RNase-free的去離子水中，60°C促溶10 min ;即得所需總RNA ;可微量分光光度計NanoDropND-2000 Spectrotometer定量檢測，電泳分析RNA的完整性。
[0024]3、利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根，DP305)提取DNA，具體步驟如下:
(I)取小麥葉片約100 mg，加入液氮充分碾磨；(2)將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700 μ? 65°C預熱緩沖液GPl的離心管中(實驗前在預熱的GPl中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1%)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65°C水浴20 min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；(3)加入700 μ?氯仿，充分混勻，12000 rpm離心5 min ； (4)小心地將上一步所得上層水相轉入一個新的離心管中，加入700 μ?緩沖液GP2，充分混勻；(5)將混勻的液體轉入吸附柱CB3中，12000 rpm離心30 s’棄掉廢液；(6)向吸附柱CB3中加入500 μ?緩沖液⑶，12000 rpm離心30 S，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(7)向吸附柱CB3中加入600 μ?漂洗液PW，12000 rpm離心30 S，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(8)重復操作步驟(7); (9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5 min, 12000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中，即為所需的DNA。
[0025]4、利用 GoldScript cDNA 合成試劑盒(Invitrogen，c81401190)進行第一鏈 cDNA合成，具體步驟如下:
(I)在0.2 ml離心管中依次加入步驟2提取的總RNA 5 μ? (200 ngM)U0 mM dNTPmix I μ?,Oligo dT Primer I Pl、DEPC 水 3 μ? ; (2)將上述 RNA/引物混合物放置在 65°C孵育5 min，然后放置在冰上1-2 min ; (3)在另一管中，配制2 X反應混合液，按順序加入下列組分:10XRT緩沖液 2 μ1，25 mM MgCl2 4 μ1，0.I M DTT 2 μ?，重組RNase抑制劑(40U/μ?) I μ? ; (4)向上述第(2)步的每個RNA/引物預混液中加入9 μι 2 X反應預混液，輕柔混勻，7500 rpm 離心 30 s;(5)42°C 孵育 2 min ;在每個管中加入 ?μ? GoldScript RT ；42°C孵育50 min ;(6) 70°C孵育15 min，終止反應，冰上冷卻；(8) 7500 rpm離心30 S，向每個管中加入 I μ? RNaseH，37°C孵育 20 min，_20°C保存。
[0026]5、聚合酶鏈式反應(PCR)反應進行序列擴增
用TaUreG-FlM引物分別對小麥cDNA和gDNA進行PCR擴增；
其 PCR 擴增體系為 50 μ 1，包括:5XPrimeSTAR GXL Buffer 10 μ?，dNTP Mixture 4μ?，上游引物(10 μ Μ) 2.5 μ 1，下游引物(10 μΜ)2.5μ1，模板
cDNA 或 gDNA 2 μ?, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa,R050Q) 0.5 μ?, ddH20 28.5μι。
[0027]其PCR擴增反