一種用生物技術生產(chǎn)中藥材原料喜樹堿的方法
【技術領域】
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[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，是一種將雙關鍵酶基因通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化喜樹，從而提高毛狀根喜樹堿產(chǎn)量的方法。
【背景技術】
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[0002]喜樹堿是喜樹中提取出來的一種具有顯著抗腫瘤活性的生物堿，已有多種喜樹堿類藥物如依立替康和拓撲替康獲得美國FDA認證，在臨床上被廣泛用于治療卵巢癌、直腸癌及白血病等多種惡性腫瘤，市場需求十分巨大。目前世界上喜樹堿類藥物的生產(chǎn)主要是從喜樹等植株中提取，然而由于喜樹天然資源數(shù)量有限，生長十分緩慢，喜樹堿及其類似物在植物體內(nèi)含量又非常低，且提取環(huán)節(jié)多、費時費力，所以從天然喜樹中提取喜樹堿的方法已遠遠不能滿足人們對喜樹堿日益增長的需求。
[0003]多年來，國內(nèi)外學者圍繞著擴大喜樹堿藥源問題進行了諸多領域的研究如化學全合成，半合成及細胞培養(yǎng)等，取得了一定的進展。喜樹堿的化學全合成雖然已經(jīng)成功，但因成本太高、產(chǎn)量太低、周期太長且易造成環(huán)境污染等因素而限制了其商業(yè)化生產(chǎn)；半合成方法雖然是目前最有效的途徑之一，但其前體的提取分離仍然依賴于天然資源的供應；細胞懸浮培養(yǎng)則存在喜樹堿產(chǎn)量低及穩(wěn)定性較差等問題同樣難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。相比之下，利用基因工程技術將喜樹堿生物合成途徑中的關鍵酶基因?qū)胂矘渲校^而獲得轉(zhuǎn)基因的發(fā)根系，并進行大規(guī)模的培養(yǎng)是提高喜樹堿產(chǎn)量的最佳途徑之一。
[0004]喜樹堿的生物合成來自于萜類吲哚生物堿。由莽草酸途徑的色胺與由5-磷酸脫氧木酮糖途徑生成的裂環(huán)馬錢子苷，在異胡豆苷合成酶(STR)催化下形成吲哚生物堿的共同前體異胡豆苷，再經(jīng)幾步酶促反應后最終生成喜樹堿和羥基喜樹堿。大量研究表明，異胡豆苷合成酶(STR)，香葉醇-10-脫氫酶(GlOH)，色氨酸脫羧酶(TDC)及1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)等關鍵酶在喜樹堿的生物合成中具有重要作用。
[0005]我們利用已克隆的長春花CrSTR和CrGlOH基因，構(gòu)建植物雙價表達載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1為介導，將異胡豆苷合成酶CrSTR和香葉醇_10_脫氫酶CrGlOH基因同時導入喜樹下胚軸組織并再生出毛狀根。通過高效液相色譜法測定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量，篩選出喜樹堿含量顯著提高的喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。
[0006]我公司采用基因工程手段，將喜樹堿合成過程中的兩個關鍵酶基因CrSTR和CrGlOH共轉(zhuǎn)化喜樹,打破了喜樹堿生物合成途徑的瓶頸效應,獲得喜樹堿高產(chǎn)的喜樹毛狀根或植株，為生產(chǎn)喜樹堿和羥基喜樹堿提供了新型優(yōu)質(zhì)藥源。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明包括如下步驟:
[0008](I)以CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列設計引物，以長春花幼苗RNA為模板PCR獲得CrSTR和CrGlOH基因片段；將CrSTR和CrGlOH基因插入植物表達載體pCAMBIA1304
質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體；
[0009](2)將獲得的重組載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；
[0010](3)利用所構(gòu)建的含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化喜樹下胚軸，獲得毛狀根；
[0011](4)檢測毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH，取篩選結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克??；
[0012](5)用高效液相色譜法測定喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根中喜樹堿含量,進一步篩選喜樹堿含量顯著提高的喜樹轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。
【具體實施方式】
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[0013]下面結(jié)合具體實施例詳細闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆建議的條件。
[0014]實施例1
[0015]長春花CrSTR及CrGlOH基因片段的獲得
[0016]1.1長春花總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成
[0017]使用TIANGEN公司提供的RNA提取試劑盒從長春花幼苗中提取總RNA (提取步驟參照試劑盒內(nèi)的說明書)。用于提取總RNA的長春花幼苗的鮮重量為0.1g左右，提取的RNA在分光光度計上測定相關的吸光值，計算所提取RNA的純度及濃度。根據(jù)不同RNA樣品的濃度，分別以0.5ug RNA為起始量，用反轉(zhuǎn)錄酶進行第一鏈cDNA的合成(操作步驟參照Promega公司提供的相關說明書)。
[0018]1.2CrSTR和CrGlOH基因片段的獲得
[0019]根據(jù)CrSTR和CrGlOH基因的編碼序列，分別設計擴增出完整的上下游特異引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點，以便構(gòu)建植物表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行測序。
[0020]實施例2
[0021]含長春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表達載體的構(gòu)建
[0022]2.1中間載體pCAMBIA1304的構(gòu)建
[0023]以pBI121和pCAMBIA1304為材料，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1304。具體地，Hindlll/EcoRl 雙酶切 pBI 121 和 pCAMBIA1304 ;回收 pBI 121-GUS 表達盒及 pCAMBIA1304大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落抽提質(zhì)粒酶切驗證。
[0024]2.2植物表達載體pCAMBIA1304-CrG10H的構(gòu)建
[0025]用從長春花中克隆的CrGlOH基因替換中間載體pCAMBIA1304的⑶S基因。具體地，BamHI/SacI 雙酶切 pMD18T_CrG10H 和 pCAMBIA1304 ;回收 CrGlOH 基因和 pCAMBIA1304大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克隆。
[0026]2.3 植物表達載體 pCAMBIA1304-CrSTR-CrG10H 的構(gòu)建
[0027]用從長春花中克隆的CrSTR基因替換pCAMBIA1304_CrG10H上的GFP+GUS基因。具體地，Bglll/BstEII 雙酶切 pMD18T-CrSTR 和 pCAMBIA1304— CrGlOH，回收 CrSTR 基因及pCAMBIA1304-CrG10H大片段；連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克隆。
[0028]實施例3
[0029]發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1介導CrSTR和CrGlOH基因轉(zhuǎn)化喜樹
[0030]3.1發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得
[0031]將含CrSTR和CrGlOH基因的植物雙價表達載體pCAMIA1304_CrSTR-CrG10H轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中，挑取單克隆菌落進行PCR驗證。
[0032]3.2外植體的預培養(yǎng)
[0033]剪取喜樹無菌3cm長下胚軸，接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基B5上，25°C暗培養(yǎng)2d。
[0034]3.3發(fā)根農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
[0035]將上述預培養(yǎng)的喜樹下胚軸外植體，放入含活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡10分鐘后，用無菌吸水紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基B5中，暗培養(yǎng)2d。
[0036]3.4毛狀根的誘導和繼代培養(yǎng)
[0037]將上述外植體轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基(B5+Cef500mg/1)中，25°C光照培養(yǎng)2_3周，可從外植體傷口處長出毛狀根。剪下3cm長毛狀根，接種于B5+Cef500mg/1培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3周。轉(zhuǎn)入B5+Cef250mg/1培養(yǎng)基中繼代篩選，每2周繼代培養(yǎng)一次。經(jīng)過數(shù)次繼代后，將生長良好的喜樹毛狀根轉(zhuǎn)入無抗生素的B5培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)20d左右。
[0038]實施例4
[0039]利用高效液相法測定轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根喜樹堿含量
[0040]4.1色譜條件及標準曲線的制作
[0041]高效液相色譜條件:色譜柱Alltech Econosi C18不銹鋼柱，流動相為乙腈:水(35: 65)，檢測波長254nm，柱溫30°C，流速lml/min，進樣量20ul。分別精密稱取2mg喜樹堿和羥基喜樹堿標準品，置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為40ug/ml的標準品液。
[0042]分別取5ul, 1ul, 15ul, 20ul, 30ul標準品液在相應色譜條件下進樣,記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品濃度(X，ug/ml)進行回歸分析。結(jié)果表明，喜樹堿和輕基喜樹堿在2.5-25mg/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。喜樹堿和輕基喜樹堿標準品的峰面積(Y)對濃度(X)的線性回歸方程為=Y = 1556.26X—1107.64，r = 0.9997。
[0043]4.2毛狀根液體培養(yǎng)
[0044]選擇生長快的毛狀根，在超凈工作臺上剪取3cm，用蒸餾水沖洗后接入200ml B5液體培養(yǎng)基中100rpm，25°C暗培養(yǎng)。每20天更換一次新鮮B5液體培養(yǎng)基，80天后收獲。取適量新鮮毛狀根用吸水紙吸干表面水分，烘干。
[0045]4.3轉(zhuǎn)基因毛狀根喜樹堿含量的提取及測定
[0046]將烘干的轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根放入研缽中充分研磨，取10mg毛狀根干粉加入甲醇10ml，超聲30min，5(TC放置過夜，次日拿出離心(12000rpm，1min)，吸取上清萃取液后，再加入甲醇1ml,超聲30min,離心(12000rpm, 1min),收集兩次的上清萃取液減壓蒸發(fā),殘余物重新用Iml甲醇溶解，樣品用0.22um濾膜過濾后取20ul，注入高效液相色譜儀，記錄各組分峰面積，代入線性回歸方程，計算即得樣品喜樹堿和羥基喜樹堿含量。
[0047]本發(fā)明利用現(xiàn)代基因工程技術將喜樹堿合成途徑中的兩個關鍵酶基因CrSTR和CrGlOH導入表達載體，并介導到喜樹中，獲得轉(zhuǎn)基因的毛發(fā)根，再篩選高表達株系進行培養(yǎng)。這就大大提高了喜樹中喜樹堿的含量,為規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎,也為解決喜樹堿藥源緊缺提供了一條較佳途徑。對于解決卵巢癌、直腸癌及白血病等惡性腫瘤病人痛苦，保障人們的健康水平，具有重大意義。
【主權項】
1.一種利用基因工程技術提高喜樹堿產(chǎn)量的方法，其特征在于包括如下步驟: (I)將異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH插入植物表達載體，構(gòu)建重組載體后，轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，構(gòu)建含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌；(2)利用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化喜樹，獲得毛狀根，并進行培養(yǎng)；(3)檢測毛狀根中的異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH，取篩選結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根克隆。
2.根據(jù)權利要求1所述提高喜樹堿產(chǎn)量的方法其特征在于所用植物表達載體為PCAMBIA質(zhì)粒和pBI質(zhì)粒。
3.根據(jù)權利要求1所述提高喜樹堿產(chǎn)量的方法其特征在于重組載體含有異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶基因CrGlOH。
4.根據(jù)權利要求1所述提高喜樹堿產(chǎn)量的方法其特征在于用含有重組載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化喜樹下胚軸，獲得毛狀根。
5.根據(jù)權利要求1所述提高喜樹堿產(chǎn)量的方法其特征在于喜樹堿含量的檢測方法為高效液相色譜法。
【專利摘要】本發(fā)明是一種生物技術領域的提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法。從長春花中克隆出異胡豆苷合成酶基因CrSTR和香葉醇-10-脫氫酶CrGlOH的編碼框序列，構(gòu)建含上述雙關鍵酶基因的植物雙價高效表達載體，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化喜樹獲得轉(zhuǎn)基因的喜樹毛狀根。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因喜樹毛狀根中喜樹堿含量顯著提高，喜樹堿含量達到對照的6.1倍，羥基喜樹堿含量達到對照的2.8倍。本發(fā)明提供了一種提高喜樹毛狀根中喜樹堿含量的方法，為生產(chǎn)具重要臨床需求的抗癌藥物喜樹堿和羥基喜樹堿提供了一種新途徑。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-84
【公開號】CN104762317
【申請?zhí)枴緾N201410001193
【發(fā)明人】王文杰
【申請人】王文杰
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月3日