利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程成骨細(xì)胞 的方法，特別是一種利用Runx2基因表達(dá)及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物 forskolin，在地塞米松存在的條件下誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞的方法，屬細(xì)胞 生物學(xué)與組織工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨組織工程技術(shù)通過(guò)把成骨細(xì)胞和/或能引導(dǎo)骨組織再生的生物活性因子整合 植入特殊的支架結(jié)構(gòu)中以作為組織工程復(fù)合骨，希望替代傳統(tǒng)的移植材料和技術(shù)。因此，骨 組織工程需要大量種子細(xì)胞和專門的支架材料以支持細(xì)胞黏附和分化。傳統(tǒng)應(yīng)用的種子細(xì) 胞包括分化晚期的成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞株、骨髓混合細(xì)胞或純化的間充質(zhì)干細(xì)胞。但此類細(xì) 胞的來(lái)源有限、獲取過(guò)程復(fù)雜并伴隨供體較重的傷害，因而廣泛應(yīng)用受到限制。
[0003]與骨髓來(lái)源細(xì)胞相比，非成骨細(xì)胞如皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源豐富、很容易從患者獲 取并進(jìn)行體外長(zhǎng)期大量擴(kuò)增培養(yǎng)?，F(xiàn)在利用細(xì)胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)已經(jīng)可以使皮膚成纖維細(xì)胞直 接轉(zhuǎn)變成成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種不同類型的功能細(xì)胞，或先轉(zhuǎn)變成多 能干細(xì)胞再進(jìn)一步定向分化成神經(jīng)細(xì)胞或各種不同類型的功能性體細(xì)胞。引人注目的是， 這些從皮膚細(xì)胞直接或間接轉(zhuǎn)分化而得到的功能性神經(jīng)細(xì)胞或體細(xì)胞已經(jīng)不再保持原來(lái) 母細(xì)胞的基因表達(dá)譜等分子與細(xì)胞特性，卻獲得了各種目的細(xì)胞的典型特征與功能。另外 這些誘導(dǎo)性功能細(xì)胞不僅可以用來(lái)模擬相關(guān)的疾病，有的還成功地通過(guò)移植到疾病動(dòng)物模 型達(dá)到治療目的。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)高效、快速、特異性的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，一般需要經(jīng)過(guò)系統(tǒng)、廣泛的篩選確定 特異的轉(zhuǎn)錄因子等基因組合，在特定情況下人細(xì)胞可能比動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)分化所需要的基因組 合會(huì)復(fù)雜一些，有的轉(zhuǎn)錄因子還需要相應(yīng)的信號(hào)分子協(xié)同作用才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)分化作用，比如 我們發(fā)現(xiàn)了 NGN2介導(dǎo)的人皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)分化到神經(jīng)細(xì)胞就必須有兩種小分子化合物的協(xié)同 作用。目前已有報(bào)道的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化因子如BMP-2，BMP-7,LMP3單獨(dú)或協(xié)同作用可以使 皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為在體外、體內(nèi)都具有骨形成作用的成骨細(xì)胞。這幾種基因表達(dá)產(chǎn) 物為分泌性的蛋白質(zhì)，其表達(dá)分泌調(diào)控復(fù)雜。由于它們能通過(guò)旁分泌作用于周圍的非骨質(zhì) 組織引起異位骨形成，在轉(zhuǎn)分化細(xì)胞中長(zhǎng)期持續(xù)高表達(dá)可能導(dǎo)致對(duì)移植部位周圍健康組織 的副作用。
[0005]2006年，ANDRE' S J. GARCFA報(bào)道，通過(guò)使用對(duì)成骨細(xì)胞起決定性作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn) 錄因子，如在骨組織細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Runx2,在單獨(dú)用于轉(zhuǎn)分化時(shí)沒有效果，在 有激素信號(hào)分子地塞米松的協(xié)同作用使大鼠的皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞。2013年 鄧宏魁報(bào)道，通過(guò)篩選了 10000種小分子化合物后，找到4種小分子，可以實(shí)現(xiàn)皮膚成纖維 細(xì)胞的重編程，其中CHIR99021和Forskolin在重編程過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。
[0006] 此外，化學(xué)小分子誘導(dǎo)細(xì)胞重新編程轉(zhuǎn)變特定類型的細(xì)胞有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：①誘導(dǎo) 過(guò)程短，藥物可高效到達(dá)靶細(xì)胞；②可控性，可以準(zhǔn)確控制藥物達(dá)到需要的濃度；③成本 低，化學(xué)小分子一旦確定可以大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種利用必需的基因/小分 子組合（Runx2/CHIR99021和Forsko 1 in)，在細(xì)胞表達(dá)Runx2的基礎(chǔ)上，用一定比例的小分 子CHIR99021和Forskolin組合，誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或治療與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的疾病的 藥物組合物，前期在高濃度9 y m的CHIR99021和10 y mForskolin的組合，保持外源導(dǎo)入的 Runx2持續(xù)一定時(shí)間的表達(dá)，在地塞米松的協(xié)同作用下，向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)。
[0009] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案完成本發(fā)明目的：一種利用Runx 2和小分子化合物誘 導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程為成骨細(xì)胞的方法，其特征是利用Runx2基因的表達(dá)及小分子化合 物CHIR99021和forskolin，誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞。
[0010] 先構(gòu)建攜帶Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮膚成纖維細(xì)胞，使正常人皮膚成纖維 細(xì)胞表達(dá)Runx2,放置普通培養(yǎng)液培養(yǎng)3~7天后，在該普通培養(yǎng)液再加入小分子化合物 6 yM~12 yM的forskolin + 5~15nM的地塞米松兩種物質(zhì)，組成激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液， 在該激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液中再進(jìn)行7~15天的細(xì)胞培養(yǎng)，隨后利用成骨細(xì)胞分化液進(jìn)行誘 導(dǎo)（37° C，5%C02)，5~7天后可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞； 所述普通培養(yǎng)液是指：1〇%胎牛血清+ l〇〇U/ml青霉素+ 100μg/ml鏈霉素+高糖 DMDM培養(yǎng)基，在37° C，5%C02環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞； 所述成骨細(xì)胞分化液配方為：1〇%胎牛血清（Hyclone) + 100U/ml青霉素（Sigma) + 100μg/ml鏈霉素（Sigma) +高糖DMDM培養(yǎng)基（Gibco)+ lOmM0-甘油磷酸+ 100nM地塞 米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate ;在 37。C，5%C02 環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0011] 所述激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液還可以是在普通培養(yǎng)液再加入5~10 yM的小分子化合 物CHIR99021物質(zhì)，則在普通培養(yǎng)液添加由CHIR99021 (5~10yM)+ forskolin (6yM~ 12 y M) +地塞米松（5~15nM)三者混合液組成的混合液，即是激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液。
[0012] 組成激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液中最佳量為：9uM小分子化合物CHIR99021+10uM小分子 化合物f〇rskolin+10nM地塞米松。
[0013] 所述的利用Runx2和小分子化合物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞重編程成骨細(xì)胞的方法，步 驟是 a. 所采集的成骨細(xì)胞是由普通人皮膚細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)直接轉(zhuǎn)分化而 得，該皮膚細(xì)胞不需要傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS)四因子（c-Myc，Klf4，0ct4, Sox2)， 因而不經(jīng)過(guò)干細(xì)胞階段，避免移植時(shí)成瘤風(fēng)險(xiǎn)； b. 所利用激素信號(hào)分子誘導(dǎo)液中的地塞米松與小分子化合物CHIR99021和/或小分 子化合物forskolin在一定濃度下的組合，搭配上述Runx2表達(dá)的人皮膚成纖維細(xì)胞，且維 持Runx2 -定的表達(dá)時(shí)間窗口 11天~15天，以及早期使得(轉(zhuǎn)分化啟動(dòng)后6~11天后)堿 性磷酸酶(ALP)在細(xì)胞中的表達(dá)，可以得到該成骨種子細(xì)胞； 所述堿性磷酸酶（ALP)是指：成骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物之一，成骨分化的過(guò)程中早期表 達(dá)的蛋白。
[0014] 具體步驟是： 一、 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng) 1.1細(xì)胞培養(yǎng) 先采集普通人皮膚成纖維細(xì)胞，將人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清 (Hyclone) + 100U/ml 青霉素（Sigma) + 100 μg/ml 鏈霉素（Sigma) + 高糖 DMDM組成的 普通培養(yǎng)液（Gibco)中并貼壁于包被有明膠的6孔板中；接種細(xì)胞密度5~6xl03/cm 2培 養(yǎng)于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中； 1. 2質(zhì)粒構(gòu)建 將全長(zhǎng)Runx2 (來(lái)源于人類）的cDNA插入到含GFP的pVSVG載體中，另外還有僅含有 GFP的pVSVG的空載； 二、 病毒侵染細(xì)胞 慢病毒包裝與感染：目的基因（Runx2)質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒通過(guò)Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，獲得了高滴度的病毒，分別對(duì)此細(xì)胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和 GFP-PVSVG空載的慢病毒，感染效率分別可達(dá)到61%和93. 4% ; 三、 小分子誘導(dǎo) 將病毒感染后的皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)3~7天，使用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，配方是：10 %胎 牛血清（Hyclone) + 100U/ml 青霉素（Sigma) + 100μg/ml 鏈霉素（Sigma)+ 高糖DMDM培 養(yǎng)基（Gibco); 之后更換為在普通培養(yǎng)液添加有小分子化合物后組成的激素信號(hào)分子誘導(dǎo)劑再培 養(yǎng)7~15天，激素信號(hào)分子誘導(dǎo)劑包括10%胎牛血清（辦〇1〇1^)+10(^/1111青霉素 (Sigma) + 100 μg/ml 鏈霉素（Sigma) + 高糖 DMDM培養(yǎng)基（Gibco) + 9 yM 的 CHIR99021 (濃度范圍：5~10uM) + lOuMForskolin (濃度范圍：6yM~12yM )+ 10nM地塞米松； 四、 成骨分化培養(yǎng)液 隨后再更換為成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，成骨細(xì)胞分化液包括10%胎牛血清 (Hyclone) + 100U/ml 青霉素（Sigma) + 100 μg/ml 鏈霉素（Sigma) + 高糖 DMDM 培養(yǎng)基 (Gibco)+ 10mMf3 甘油磷酸 + 100nM 地塞米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每 隔2~3天更換一次成骨細(xì)胞分化液，持續(xù)誘導(dǎo)5天以上；其后的細(xì)胞培養(yǎng)，一直使用成骨 細(xì)胞分化液維持； 五、 茜素紅染色鑒定 ① 將舊的誘導(dǎo)液吸除，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞暴露，利用PBS清洗細(xì)胞3次； ② 取含4%多聚甲醛的固定液固定細(xì)胞30min ; ③ 去固定液，利用2%的茜素紅染液，37°C，孵育30min，可放在培養(yǎng)箱中進(jìn)行； ④ 棄去茜素紅染色液，利用超純水清洗3次以上，以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性 ⑤ 在倒置顯微鏡下拍照實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
[0015] 本發(fā)明所采集的成骨細(xì)胞是由普通人皮膚細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)直接 轉(zhuǎn)分化而得，該皮膚細(xì)胞不需要傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS)四因子（c-Myc，Klf4， 0ct4, Sox2)，因而不經(jīng)過(guò)干細(xì)胞階段，避免移植時(shí)成瘤風(fēng)險(xiǎn)。
[0016] 本發(fā)明方法能簡(jiǎn)單、快速可以將人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分分化為成骨細(xì)胞，則獲得 特異性地獲取誘導(dǎo)性成骨細(xì)胞，它可以促進(jìn)骨形成并有助于治療多種骨病，例如骨質(zhì)疏松， 骨折等骨代謝疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1本發(fā)明人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞的方法示意圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明Runx2感染人皮膚成纖維細(xì)胞效率。
[0019] 圖3為本發(fā)明人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞的鑒定。在圖3中：a，正常人 皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)形態(tài)；b，轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)（綠色熒光表示）；c，轉(zhuǎn) 分化過(guò)程中，細(xì)胞堿性磷酸酶染色；d，轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞后形成的礦化結(jié)節(jié)（團(tuán)塊紅色）； e，ALP (堿性磷酸酶）和Runx2基因的表達(dá)鑒定。
[0020] 圖4為轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞進(jìn)行小鼠的皮下移植，形成新生骨。在圖4中a，細(xì)胞小鼠 皮下移植后，形成的新生骨（圈內(nèi)）；b，白光下看的a圖移植物的切片鑒定；c，紫外光看的 a圖移植物的切片鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明利用Runx2基因的表達(dá)及小分子化合物CHIR99021和forskolin，誘導(dǎo)人成 纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞的