一種將hpalXoo基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法
【專利說明】—種將基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種將如基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]定向的改造野生型菌株，使之適合不同環(huán)境、不同靶標(biāo)的生物防治，無疑具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。因此近年來，人們開始熱衷于利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的手段進(jìn)行生防菌的遺傳改良，改善它們對環(huán)境條件的適應(yīng)性、擴(kuò)大應(yīng)用范圍。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中研究較成熟的菌株是枯草芽孢桿菌，但是由于其胞外蛋白酶活性很強(qiáng)，會大量降解外源蛋白，所以在構(gòu)建工程生防菌株時(shí)造成較大的局限性；蘇云金芽孢桿菌雖然胞外蛋白酶活性不高，但是野生菌株中含有大量的內(nèi)生質(zhì)粒，而這些內(nèi)生質(zhì)粒對外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)帶來較大的影響；短芽孢桿菌和短短芽孢桿菌則只有枯草芽孢桿菌的1.6%胞外蛋白酶活性(Udaka etal.1993)并且細(xì)胞壁較薄，內(nèi)生質(zhì)粒較少,所以成了生防菌株和外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建中宿主細(xì)胞的重要選擇。
[0003]目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡懈惺軕B(tài)法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法雖然有較高的轉(zhuǎn)化率，但由于短芽孢桿菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)(由外蛋白層和內(nèi)肽聚糖層組成)，去掉細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體再生非常困難，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法不能運(yùn)用于短芽孢桿菌(UDAKA S.etal 1989)。其中，電擊轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而，電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系，隨著電場強(qiáng)度的增加，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等以不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高轉(zhuǎn)化率為2.58 X 14 cfu/ug ;王培培等對枯草芽孢桿菌NCD電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，最高效率為6.07 X 14 cfu/ug ;而目前芽孢桿菌電擊轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率最高為1.4X106 cfu/ug，還不能滿足高效率轉(zhuǎn)化，如構(gòu)建基因文庫的要求。且電擊轉(zhuǎn)化法對試驗(yàn)技能有較高的要求，電場強(qiáng)度是電擊轉(zhuǎn)化中最敏感的參數(shù)，直接影響轉(zhuǎn)化效率；外加電場引起細(xì)胞部分原生質(zhì)化，在沒有特殊再生條件的情況下，部分轉(zhuǎn)化子將會死亡，降低了轉(zhuǎn)化子獲得率。李瑞芳等(2011)比較了電擊轉(zhuǎn)化法和本研究所使用的化學(xué)轉(zhuǎn)化法對枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)電擊轉(zhuǎn)化法對細(xì)胞分泌表達(dá)的損傷大于化學(xué)轉(zhuǎn)化法。
[0004](彭清忠等2004)也嘗試用適用于各種細(xì)菌轉(zhuǎn)化的TSS法轉(zhuǎn)化5株短芽孢桿菌，但都未成功。由此看來，此方法并不是對每種細(xì)菌都適用。短芽孢桿菌由于其特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及各菌株之間的結(jié)構(gòu)差異，找到一種通用的有效轉(zhuǎn)化方法還存在一定困難。Tris-PEG方法是一種新的轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌的方法。Udaka等利用此方法轉(zhuǎn)化具有雙層細(xì)胞壁蛋白的短芽孢桿菌47時(shí)非常成功，最佳條件下轉(zhuǎn)化率高達(dá)105~ 16個(gè)轉(zhuǎn)化子/ UgDNA。但在轉(zhuǎn)化僅有I層細(xì)胞壁蛋白層的短芽孢桿菌HPD31時(shí)獲得非常低的轉(zhuǎn)化率或沒有轉(zhuǎn)化子獲得。彭清忠等也利用此方法嘗試對5株野生短芽孢桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)，僅50號和735號菌獲得成功，且轉(zhuǎn)化效率非常低(最高轉(zhuǎn)化率102個(gè)轉(zhuǎn)化子/ ugDNA)?？傮w看來，Tris-PEG轉(zhuǎn)化方法并不適合于所有的短芽孢桿菌，而且由于菌株的不同，轉(zhuǎn)化效率有很大的區(qū)別。周海燕等(2008)采用Tris-PEG將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至短短芽孢桿菌且其酶活力顯著提高。所以這些例子都為功能基因的研究奠定了基礎(chǔ)。
[0005]HAB-5是一株從棉花根際土壤分離出來的拮抗細(xì)菌，經(jīng)16SrRNA初步鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevs)，研究發(fā)現(xiàn)其對多株植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，且在促進(jìn)植株生長，防治植物病害方面也有一定的作用。
[0006]hpalXoo是來自水稻白葉枯病菌(Z oryzae pv.0ryzae)菌株JXO III的ArjD基因簇中的hpa (harpin-associated)基因,編碼harpinXoo蛋白。這種蛋白具有Harpin的特征，且可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種有益表型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提出一種將基因如Wzra轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，操作簡便，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)化率高。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
(1)將短短芽孢桿菌HAB-5在LB平板上活化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得短短芽孢桿菌HAB-5菌液；
(2)轉(zhuǎn)接經(jīng)步驟(I)培養(yǎng)的HAB-5菌液到MD培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(3)離心后倒去上清液剩余懸浮菌體，即得HAB-5懸浮菌體溶液；
(4)HAB-5懸浮菌體溶液加入如!混合菌液，200-250rpm振蕩培養(yǎng)；
(5)加入混合菌液體積10倍的LB，200-250rpm振蕩恢復(fù)培養(yǎng)；
(6)離心后除去上清液，即得含有hpalXoo基因的HAB-5；
進(jìn)一步，所述步驟(I)培養(yǎng)條件為，27-29°C振蕩160-180rpm培養(yǎng)12-16個(gè)小時(shí)。
[0009]進(jìn)一步，所述步驟(2)培養(yǎng)條件為，27-29°C振蕩160_180rpm培養(yǎng)3-5 h ；
進(jìn)一步，所述步驟(2)中MD培養(yǎng)基每10 mL中含有以下組分:10XPC緩沖液0.92mL,
50%葡萄糖 0.1mL (115°C滅菌 30min), 5mg/mL_ 色氨酸 0.1mL, 2.2mg/mL 朽1 檬酸鐵銨 0.005mL, 0.5mol/L 天門冬氨酸鉀 0.24 mL, lmol/L 硫酸續(xù) 0.03 mL。
[0010]進(jìn)一步，所述的10XPC緩沖液各組分的摩爾濃度為:磷酸二氫鉀44mmol/L，磷酸氫二鉀60mmol/L,朽1樣酸三鈉30mmol/L。
[0011]進(jìn)一步,所述步驟(3)中離心條件為,8000-10000 rpm,離心8_12min ;
進(jìn)一步，所述步驟(4)中hpalXoo的加入量為每毫升懸浮菌體溶液加入0.5-0.8 Ug的如振蕩培養(yǎng)條件為溫度27-29°C、培養(yǎng)2_3h ；
進(jìn)一步，所述步驟(5)中恢復(fù)培養(yǎng)過程中，控制溫度27-29°C，培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間為2-3 h。
[0012]進(jìn)一步,所述步驟(6)離心條件為8000-10000rpm離心10_12min。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法屬于化學(xué)轉(zhuǎn)化法，經(jīng)過多次轉(zhuǎn)化，最高轉(zhuǎn)化率可高達(dá)14個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA0且將得到的轉(zhuǎn)化子超聲破碎得到的粗蛋白注射到煙草葉片中，25°C ±1°C下放置，24h后觀察煙草葉片有過敏性反應(yīng)發(fā)生。說明轉(zhuǎn)入的如Wzra基因在短短芽孢桿菌中能高效穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明建立的將如基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，操作簡便，營養(yǎng)要求低，儀器設(shè)備無特殊要求，耗時(shí)短，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)化效率高，對于構(gòu)建更高效的生防菌株具有積極的促進(jìn)意義。
【附圖說明】
[0014]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0015]圖1為HAB培養(yǎng)后的菌落生長情況；
圖2為實(shí)施例1所得轉(zhuǎn)化子菌落生長情況；
圖3為實(shí)施例2轉(zhuǎn)化子菌落生長情況；
圖4為實(shí)施例3轉(zhuǎn)化子菌落生長情況；
圖 5 為突變體的PCR檢測，圖中，M:2000Mark ；1: Blxoo ；2:B2xoo ；3:B3xoo ；4:B4xoo ；5:B5xoo ;6:作為重組融合蛋白GST-harpinXoo的宿主菌株E.coli菌株BL21 (DE3)；7:HAB-5 ；
圖 6 為 PCR Southern Blot 驗(yàn)證，圖中，MiMarker ；1:HAB-5 ；2:B4xoo ；3:B5xoo ；
圖7為煙草的過敏性反應(yīng)檢測，圖中，a:ddH20 ；b: GST-HarpinXoo粗蛋白；c:HAB-5粗蛋白；d:B5xoo粗蛋白
圖8為菌體總粗蛋白SDS-PAGE電泳，圖中，M =Protein Marker ；1:HAB-5粗蛋白2:GST-HarpinXoo 粗蛋白 3:B5xoo 粗蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面將結(jié)合