一種紅球菌催化生產(chǎn)煙酰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種紅球菌催化合成煙酰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙酰胺(VB3)，又名尼克酰胺(Nicotinamide)，分子式C6H6N20，分子量122.13，為白色針狀結(jié)晶或粉末，熔點(diǎn)129?131°C。易溶于水、能溶于醇和甘油，不溶于醚，微毒。其結(jié)構(gòu)式如下:
煙酸、煙酰胺屬B族維生素，統(tǒng)稱維生素PP，在實(shí)際應(yīng)用中可等量替代，自然界的煙酸存在于肝、腎、酵母和米糠中，是生物體內(nèi)脫氫輔酶I或II的組分，參與碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。它們?cè)卺t(yī)藥中可用于治療糙皮病等，還可以添加到食品和面粉中用以補(bǔ)充人體所需的維生素，其最大的應(yīng)用領(lǐng)域是用作飼料添加劑。
[0003]工業(yè)上，煙酰胺、煙酸主要是以吡啶類化合物為原料生產(chǎn)的，世界煙酰胺、煙酸的生產(chǎn)主要集中在西歐和美國(guó)，日本也有少量生產(chǎn)。全球煙酰胺、煙酸主要生產(chǎn)國(guó)有瑞士、比利時(shí)、美國(guó)、日本及中國(guó)等。主要生產(chǎn)廠家有瑞士龍沙(1.5萬(wàn)t/a)、比利時(shí)德固賽、美國(guó)Reilly、日本Yuyigosei公司以及美國(guó)內(nèi)貝塔公司等。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家受原料進(jìn)口限制，生產(chǎn)規(guī)模普遍較小，主要有廣州龍沙(屬于瑞士龍沙)、江蘇南通醋酸化工、浙江新昌制藥廠等。我國(guó)煙酸、煙酞胺的產(chǎn)量很少，只用于制藥工業(yè)，飼料工業(yè)中大量所需的煙酸、煙酞胺主要依賴進(jìn)口。因此，開(kāi)發(fā)和建設(shè)具有一定經(jīng)濟(jì)規(guī)模的煙酸、煙酰胺生產(chǎn)裝置，不僅有很大的市場(chǎng)空間，還有巨大的社會(huì)意義。
[0004]煙酰胺、煙酸的合成工藝有化學(xué)合成法和生物催化法兩種?；瘜W(xué)合成法主要有對(duì)3-甲基吡啶(PIC)進(jìn)行氨氧化得到3-氰基吡啶(NSN)，3-氰基吡啶經(jīng)水解得到煙酰胺或煙酸。生化法主要工藝為:采用腈水合酶的固定化細(xì)胞將3-氰基吡啶水解為煙酰胺。
[0005]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)產(chǎn)腈水合酶生物催化合成煙酰胺進(jìn)行了較深入的研宄及部分的工業(yè)化應(yīng)用。主要有上海農(nóng)藥所，浙江工業(yè)大學(xué)，清華大學(xué)和中科院生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等。其中上海農(nóng)藥所成功開(kāi)發(fā)出了煙腈微生物催化為煙酰胺技術(shù)，并與浙江醫(yī)藥股份有限公司合作建立了規(guī)?；臒燉０飞a(chǎn)裝置。瑞士龍沙股份有限公司采用固定化的紅球菌屬rhodochrous微生物進(jìn)行3_氰基卩比啶的催化水合反應(yīng)，并取得的一定的成果。上述專利均采用生化法，以3-氰基吡啶為底物，以產(chǎn)腈水合酶為生物催化劑進(jìn)行水合反應(yīng)。以上傳統(tǒng)生物催化劑雖取得了一定的成果，不足之處在于產(chǎn)物濃度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)的不足，提供一種新的紅球菌進(jìn)行生物催化生產(chǎn)煙酰胺；后處理方便，產(chǎn)品純度高。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種紅球菌催化合成煙酰胺的方法，其特征在于，利用紅球菌產(chǎn)生的腈水合酶與底物3-氰基啦啶進(jìn)行催化反應(yīng)合成煙酰胺，其合成工藝如下:以3-氰基P比啶為底物，以紅球菌為生物催化劑在溫度10?40°C，攪拌轉(zhuǎn)速60?600rpm下進(jìn)行催化水合得到煙酰胺。
[0008]所述的紅球菌催化合成煙酰胺的方法，其特征在于該方法包含下列步驟:
(1)紅球菌生物催化劑的制備:
向三角瓶A中裝入20%-80%的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入1-10%的紅球菌菌種，在20-40°C下，以60-300rpm的轉(zhuǎn)速攪拌震蕩培養(yǎng)24_72h，向三角瓶B中裝入20%_80%的發(fā)酵培養(yǎng)基，消毒后接入1-10%的種子液，在通氣量0.1-0.5V.V.M ;壓力0.01-0.05MPa ;攪拌轉(zhuǎn)速:60-300rpm ;溫度:20-40°C，光照強(qiáng)度:3000Lx下發(fā)酵24_120h，即可制得紅球菌的細(xì)胞發(fā)酵液，細(xì)胞發(fā)酵液再進(jìn)行離心分離，收集沉淀物，所得到的沉淀物以1: (9-11)的質(zhì)量比加去離子水進(jìn)行稀釋，得到的懸濁液為生物催化劑液，備用；
種子培養(yǎng)基配方:5-20% 葡萄糖，0.5-5% 酵母膏，0.05-0.5%NaCl，0.05-0.3%K2HP04，0.01-0.03%MgS04，0.1-1% 尿素、0.01-0.03% 鉬酸銨，pH 7.0-7.5 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基配方:5-30%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.1-1%尿素，0.03-0.3%K2HP04，
0.01-0.l%MgS04，0.l-0.2%CaC12，0.01-0.04% 硫酸鋅，pH 6.5-7.5 ；
(2)產(chǎn)腈水合酶的催化反應(yīng)
在反應(yīng)釜中，先添加容器量的30-40%的去離子水，調(diào)pH到7.0，采用分批加料的方式先向反應(yīng)釜中首次添加底物3-氰基吡啶和生物催化劑液，在20-40°C，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每1-2小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)，同時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加底物和生物催化劑液，補(bǔ)加的量與起始量一致，底物煙腈反應(yīng)一定時(shí)間后，用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中煙腈殘留量，當(dāng)煙腈殘留量接近零時(shí)，即為生物催化反應(yīng)的終點(diǎn)，所述的3-氰基吡啶和生物催化劑液的每批添加質(zhì)量比為(9-11):1 ;
(3)純化處理
將轉(zhuǎn)化液置于1-4°C的冷凍環(huán)境下保持2h以上，產(chǎn)物煙酰胺在低溫下逐漸出現(xiàn)大量結(jié)晶體，將結(jié)晶體和水的混合液通過(guò)冷凍離心進(jìn)行分離后將結(jié)晶體在40-60°C下進(jìn)行真空干燥，最終制得煙酰胺成品。
[0009]本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的具有下列特點(diǎn):
本發(fā)明提供的紅球菌產(chǎn)腈水合酶的總酶活力高，是生化法合成煙酰胺的一種優(yōu)良菌種之一。同時(shí)本發(fā)明采用底物和產(chǎn)腈水合酶分批加料的方式多次補(bǔ)加，提高的生化反應(yīng)的酶活性及產(chǎn)物收率，減少了濃縮處理，簡(jiǎn)便了后期的分離提純的工藝。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1 一種紅球菌催化合成煙酰胺的方法，包括以下步驟:
(1)、生物催化劑制備
向IL三角瓶A中裝入60%的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入5%的菌種，在30°C下攪拌(120rpm)震蕩培養(yǎng)72h。向IL三角瓶B中裝入60%的發(fā)酵培養(yǎng)基，消毒后接入6%的種子液進(jìn)行發(fā)酵，在通氣量0.5 ;壓力0.05MPa ;攪拌轉(zhuǎn)速:120rpm ;溫度:30°C，光照強(qiáng)度:3000Lx下發(fā)酵72h進(jìn)行離心分離，收集離心分離后的沉淀物，備用，
其中，每升種子培養(yǎng)基含有下列質(zhì)量的組分(g ):葡萄糖15，酵母膏2，尿素0.6，K2HPO40.15，MgSO40.03，NaCl0.15，鉬酸銨 0.02，用濃度為 3% 的 HCl 調(diào) pH =7.5，
每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列質(zhì)量的組分(g ):葡萄糖15，酵母膏3，尿素0.6，K2HPO40.15，MgSO40.03，CaCl20.15，硫酸鋅 0.02，用濃度為 3% 的 HCl 調(diào) pH 7.0，
(2)離心分離后的沉淀物以1:10的質(zhì)量比加去離子水進(jìn)行稀釋，得到的懸濁液為生物催化劑液，向IL反應(yīng)釜加350ml去離子水，調(diào)pH到7.0，溫度為30°C，向反應(yīng)釜中添加50g3-氰基吡啶，5g生物催化劑液，每隔1.5小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L后同時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加底物和生物催化劑，補(bǔ)加的量與起始量一致，連續(xù)補(bǔ)加10次。第十次補(bǔ)加完反應(yīng)5h后檢測(cè)反應(yīng)液中3-氰基吡啶的濃度，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.02g/L時(shí)即可終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于3000rpm離心20min，取上清液在0°C下冷凍結(jié)晶3h，待產(chǎn)物煙酰胺結(jié)晶結(jié)束后通過(guò)冷凍離心分離，分離后將結(jié)晶體在60-100°C下真空干燥，最終制得的高純度的煙酰胺。煙酰胺純度為98.2%，煙酰胺質(zhì)量為833g，收率達(dá)90.9%。
[0011]實(shí)施例2
本實(shí)施例保持反應(yīng)條件及參數(shù)均與實(shí)施例1 一致，僅改變底物和生物催化劑的加料次數(shù)，考察加料次數(shù)對(duì)該催化反應(yīng)的影響。其余本實(shí)施例中先向反應(yīng)釜中添加10g 3-氰基P比啶，1g生物催化劑。當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加，補(bǔ)加的量與起始量一致，連續(xù)補(bǔ)加5次。第五次補(bǔ)加完反應(yīng)5h后檢測(cè)反應(yīng)液中3-氰基吡啶的濃度，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.02g/L時(shí)即可終止反應(yīng)。將反應(yīng)液于3000rpm離心20min，取上清液在0°C下冷凍結(jié)晶3h，待產(chǎn)物煙酰胺結(jié)晶結(jié)束后通過(guò)冷凍離心分離，分離后將結(jié)晶體在60-100°C下真空干燥，最終制得的高純度的煙酰胺。煙酰胺純度為98.0%，煙酰胺質(zhì)量為822g，收率達(dá)89.5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種紅球菌催化合成煙酰胺的方法，其特征在于，利用紅球菌產(chǎn)生的腈水合酶與底物3-氰基P比啶進(jìn)行催化反應(yīng)合成煙酰胺，其合成工藝如下:以3-氰基P比啶為底物，以紅球菌為生物催化劑在溫度10?40°C，攪拌轉(zhuǎn)速60?600rpm下進(jìn)行催化水合得到煙酰胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅球菌催化合成煙酰胺的方法，其特征在于該方法包含下列步驟: (1)紅球菌生物催化劑的制備: 向三角瓶A中裝入20%-80%的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入1-10%的紅球菌菌種，在20-40°C下，以60-300rpm的轉(zhuǎn)速攪拌震蕩培養(yǎng)24_72h，向三角瓶B中裝入20%_80%的發(fā)酵培養(yǎng)基，消毒后接入1-10%的種子液，在通氣量0.1-0.5V.V.M ;壓力0.01-0.05MPa ;攪拌轉(zhuǎn)速:60-300rpm ;溫度:20-40°C，光照強(qiáng)度:3000Lx下發(fā)酵24_120h，即可制得紅球菌的細(xì)胞發(fā)酵液，細(xì)胞發(fā)酵液再進(jìn)行離心分離，收集沉淀物，所得到的沉淀物以1: (9-11)的質(zhì)量比加去離子水進(jìn)行稀釋，得到的懸濁液為生物催化劑液，備用； 種子培養(yǎng)基配方:5-20% 葡萄糖，0.5-5% 酵母膏，0.05-0.5%NaCl，0.05-0.3%K2HP04，.0.01-0.03%MgS04，0.1-1% 尿素、0.01-0.03% 鉬酸銨，pH 7.0-7.5 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基配方:5-30%葡萄糖，0.5-5%酵母膏，0.1-1%尿素，0.03-0.3%K2HP04，.0.01-0.l%MgS04，0.l-0.2%CaC12，0.01-0.04% 硫酸鋅，pH 6.5-7.5 ； (2)產(chǎn)腈水合酶的催化反應(yīng) 在反應(yīng)釜中，先添加容器量的30-40%的去離子水，調(diào)pH到7.0，采用分批加料的方式先向反應(yīng)釜中首次添加底物3-氰基吡啶和生物催化劑液，在20-40°C，50-300rpm的攪拌速度下進(jìn)行生物催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每1-2小時(shí)對(duì)反應(yīng)液中的3-氰基吡啶濃度進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)濃度低于0.5g/L時(shí)，同時(shí)開(kāi)始補(bǔ)加底物和生物催化劑液，補(bǔ)加的量與起始量一致，底物煙腈反應(yīng)一定時(shí)間后，用HPLC法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中煙腈殘留量，當(dāng)煙腈殘留量接近零時(shí)，即為生物催化反應(yīng)的終點(diǎn)，所述的3-氰基吡啶和生物催化劑液的每批添加質(zhì)量比為(9-11):1 ; (3)純化處理 將轉(zhuǎn)化液置于1-4°C的冷凍環(huán)境下保持2h以上，產(chǎn)物煙酰胺在低溫下逐漸出現(xiàn)大量結(jié)晶體，將結(jié)晶體和水的混合液通過(guò)冷凍離心進(jìn)行分離后將結(jié)晶體在40-60°C下進(jìn)行真空干燥，最終制得煙酰胺。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公開(kāi)了一種紅球菌催化合成煙酰胺的方法。本發(fā)明采用紅球菌產(chǎn)生的產(chǎn)腈水合酶與底物3-氰基吡啶進(jìn)行催化反應(yīng)生成煙酰胺。反應(yīng)過(guò)程中采用分批添加底物和催化劑的措施，提高了轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明采用新型的腈水合酶物種，操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便，環(huán)境污染小，產(chǎn)物易于分離，產(chǎn)品純度高，有著很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12P17-12, C12R1-01
【公開(kāi)號(hào)】CN104762338
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510115780
【發(fā)明人】谷順明, 胡玉兵, 黃永升, 韋琛鴻, 王曉亭
【申請(qǐng)人】安徽國(guó)星生物化學(xué)有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日