尼帕病毒和豬瘟病毒二重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)試劑及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種尼帕病毒和豬瘟病毒二重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)試劑及其制備方法與用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 尼帕病毒（Nipah Virus，NiV)是1999年確定的一種嚴(yán)重危害家豬和人類(lèi)的新病 毒，能夠引起人和豬的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病。豬瘟（Classical Swine Fever，CSF)是 由豬瘟病毒（CSFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，根據(jù)流行毒株的毒力 強(qiáng)弱和豬免疫狀況不同呈現(xiàn)急性型、亞急性型、溫和型等臨床癥狀。由于豬的尼帕病和豬瘟 在臨床上有相似表現(xiàn)，僅憑臨床癥狀不易區(qū)分，因此對(duì)臨床疑似發(fā)病豬進(jìn)行尼帕病毒和豬 瘟病毒的鑒別檢測(cè)，不僅能夠?yàn)榧霸绨l(fā)現(xiàn)和控制這兩種動(dòng)物疫病提供病原學(xué)依據(jù)，而且還 能夠及時(shí)防控人類(lèi)尼帕病的爆發(fā)和流行。多重?zé)晒釸T-PCR方法可同時(shí)檢測(cè)多種病原核酸， 具有一次RT-PCR反應(yīng)就能簡(jiǎn)便、快速地鑒別和檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)。目前檢測(cè)單一尼帕病 毒和豬瘟病毒的熒光RT-PCR方法和公開(kāi)專利均有報(bào)道，而能夠同時(shí)檢測(cè)尼帕病毒和豬瘟 病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑及其制備方法與應(yīng)用，還罕見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種尼帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)試劑及其制備方法與用途，具體涉及一種分別以尼帕病毒M和豬瘟病毒5' UTR基因?yàn)?擴(kuò)增靶序列而研制的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑包括二對(duì)引物、二條標(biāo)記探針和二個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：一種尼 帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑，包括用于分別檢測(cè)尼帕病毒M基因和豬瘟 病毒5' UTR基因的二對(duì)特異性引物、二條特異性探針和二個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度分別 為79bp和77bp，引物和探針序列為：
[0005] 尼帕病毒
[0006]上游引物：NIPHA-M-F:5' -GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' SEQ ID NO. 1
[0007]下游引物：NIPHA-M-R :5' -AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3' SEQ ID NO. 2
[0008]探針：NIPHA-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3' -MGB SEQ ID NO. 3
[0009]陽(yáng)性對(duì)照：GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCG AGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC
[0010] SEQ ID NO. 4
[0011] 豬痕病毒
[0012] 上游引物：CSFV-5' UTR-F:5' -GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3' SEQ ID NO. 9
[0013]下游引物：CSFV-5'UTR-R:5'-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3' SEQ ID NO. 10
[0014]探針：CSFV-5' UTR-P:5' -VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3' SEQ ID NO. 11
[0015]陽(yáng)性對(duì)照：CSFV-5 ' UTR: CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGT GAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG
[0016] SEQ ID NO. 12。
[0017] 上述的尼帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑的制備方法，包括以下 步驟：
[0018] (1)選擇尼帕病毒M基因序列保守片段為擴(kuò)增和制備陽(yáng)性對(duì)照的靶目標(biāo)序列，其 核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，為：
[0019] GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGC TGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC ；
[0020] (2)選擇豬瘟病毒5' UTR基因序列保守片段為擴(kuò)增和制備陽(yáng)性對(duì)照的靶目標(biāo)序 列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 12所示，為：
[0021] CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAG ATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG ；
[0022] (3)設(shè)計(jì)4條引物，以之PCR擴(kuò)增和制備尼帕病毒M基因陽(yáng)性對(duì)照，引物序列SEQ ID NO. 5-SEQ ID N0. 8 如下：
[0023] NIPHA-M-F1:5 ' -CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGT TCC-3
[0024] NIPHA-M-R1:5 ' -GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCC AGG-3
[0025] NIPHA-M-F2:5 ' -GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGA TC-3'
[0026] NIPHA-M-R2:5 ' -GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGC TG-3 ,
[0027] (4)設(shè)計(jì)4條引物，以之PCR擴(kuò)增和制備豬瘟病毒5'UTR基因陽(yáng)性對(duì)照，引物序列 SEQ ID NO. 13-SEQ ID N0. 16,如下：
[0028] CSFV-F1:5 ' -CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGC-3 '
[0029] CSFV-F2:5 ' -GTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGG CA-3 ,
[0030] CSFV-F1:5 ' -TGCCCTCGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACG AC-3'
[0031] CSFV-R2:5 ' -CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGGCATGCCCTCGTCCACATAGCATC-3 '
[0032] (5)根據(jù)尼帕病毒M基因陽(yáng)性對(duì)照序列和豬瘟病毒5'UTR陽(yáng)性對(duì)照序列設(shè)計(jì)多對(duì) 引物和多條探針，經(jīng)過(guò)大量的對(duì)比篩選試驗(yàn)，確定最適的引物對(duì)和標(biāo)記探針組合：
[0033] 尼帕病毒
[0034]上游引物：NIPHA-M-F:5' -GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3' SEQ ID NO. 1
[0035]下游引物：NIPHA-M-R :5' -AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3' SEQ ID NO. 2
[0036]探針：NIPHA-M-P:5' -FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3' -MGB SEQ ID NO. 3
[0037] 豬瘟病毒
[0038]上游引物：CSFV-5' UTR-F:5' -GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3' SEQ ID NO. 9
[0039] 下游引物：CSFV-5'UTR-R:5'-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3' SEQ ID NO. 10
[0040] 探針：CSFV-5'UTR-P:5'-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3' SEQ ID NO. 11
[0041] (6)檢測(cè)尼帕病毒M基因的探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的 非熒光淬滅基團(tuán)為MGB ;檢測(cè)豬瘟病毒5' UTR基因的探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是 VIC，3'端標(biāo)記的非熒光淬滅基團(tuán)為MGB ;
[0042] (7)經(jīng)過(guò)大量的對(duì)比試驗(yàn)和反應(yīng)條件優(yōu)選，確定二重?zé)晒釸T-PCR最適的反應(yīng)條 件、引物及探針的特異性和靈敏度。
[0043] 所述（5)中的最適的反應(yīng)條件為檢測(cè)尼帕病毒M基因和豬瘟病毒5'UTR基因的 上、下游引物使用濃度均為15pmol/ y L，探針的使用濃度均為5. Opmol/ y L，在25 y L體系 中均加入〇.5yL的引物及探針，引物及探針的特異性使其區(qū)別于豬源其它病毒，檢測(cè)尼帕 病毒M基因和豬瘟病毒5' UTR基因的靈敏度分別達(dá)到46個(gè)拷貝和110個(gè)拷貝。
[0044] 所述的尼帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑在生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒中 的應(yīng)用。
[0045] 所述的尼帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑在繪制尼帕病毒和豬瘟 病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的用途。
[0046] 本發(fā)明的有益效果是：⑴具有特異、敏感、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，可用于同時(shí)檢測(cè)家 豬及其相關(guān)樣本中的微量尼帕病毒和豬瘟病毒核酸。（2)本發(fā)明中的尼帕病毒M基因和豬 瘟病毒5' UTR基因?qū)φ罩苽浞椒?，既不涉及尼帕病毒和豬瘟病毒及其基因組核酸的使用， 也不需要人工合成較長(zhǎng)的尼帕病毒M基因RNA片段和豬瘟病毒5' UTR基因RNA片段，具有 簡(jiǎn)便、安全和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針對(duì)尼帕病毒M基因陽(yáng)性對(duì)照的熒光RT-PCR擴(kuò)增曲 線。
[0048] 圖2為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針對(duì)尼帕病毒M基因的熒光特異性擴(kuò)增曲線。
[0049] 圖3為對(duì)4. 6X107~4. 6X10 kopies/yL濃度范圍內(nèi)的尼帕病毒M基因陽(yáng)性對(duì) 照的熒光定量RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。
[0050] 圖4為尼帕病毒M基因的熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0051] 圖5為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針對(duì)豬瘟病毒5' UTR基因陽(yáng)性對(duì)照的熒光RT-PCR擴(kuò) 增曲線。
[0052] 圖6為最適引物對(duì)與標(biāo)記探針對(duì)豬瘟病毒5' UTR基因的熒光RT-PCR特異性擴(kuò)增 曲線。
[0053] 圖7為對(duì)1.1\108~1.1\102(：叩化 8/1^濃度范圍內(nèi)的豬瘟病毒5'^'1?基因陽(yáng) 性對(duì)照的熒光定量RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。
[0054] 圖8為豬瘟病毒5' UTR基因的熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0056] 本發(fā)明的尼帕病毒和豬瘟病毒的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)試劑及其制備方法與用 途，包括以下步驟。
[0057] 第一步驟是制備尼帕病毒M基因的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)（RNA)，過(guò)程包括：
[0058] (1)在NCBI網(wǎng)站中，對(duì)尼帕病毒M基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇一段保守序列用 于M基因陽(yáng)性對(duì)照制備，如SEQ ID N0. 4所示。
[0059] (2)基于SEQ ID NO. 4序列設(shè)計(jì)合成4條引物，引物序