模擬肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及心血管疾病的預(yù)后、診斷或治療中有用的肽。
【背景技術(shù)】
[0002]載脂蛋白A-I(ApoA-I)是高密度脂蛋白（HDL)中最豐富的蛋白（70% )，已知其濃 度與心血管疾病風(fēng)險呈負相關(guān)。HDL相關(guān)的ApoA-I通過調(diào)節(jié)反向膽固醇運輸并將其輸送 至肝臟而在膽固醇體內(nèi)平衡中扮演關(guān)鍵角色（￥311〇67 6七31;2003,41^61'；[08(3161\1111'011113. Vase.Biol. 23:712-719)。HDL相關(guān)ApoA-I還具有抗炎性以及具有抗氧化性。
[0003] 在罹患系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的病人中已指示有高水平的針對IgG亞型 的ApoA-I的自身抗體（抗-ApoA-IIgG)，這是與很高的心血管疾?。–V)風(fēng)險相關(guān) 的自身免疫病癥 0>inuetal，1998,Lupus7:355 - 360)?？?ApoA-IIgG自身抗體 已在其他高CV風(fēng)險種群中被描述，包括在心肌梗塞（MI)病人中（Vuilleumieret al, 2010a,Eur.HeartJ. 31:815 - 823)、在患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的病人中（Vuilleumier etal, 2010b,ArthritisRheum. 62:2640 - 2650)、在患有急性胸痛的病人中（Keller etal, 2012,J.Intern.Med. 271:451 - 462)，以及在患有頸動脈重度狹窄的病人中 (Montecuccoetal，2011，Eur.Hea;rtJ.32:412_421)。在MI和RA病人中，抗-ApoA-I IgG自身抗體顯示為獨立地與高CV風(fēng)險種群中的CV疾病的增高的風(fēng)險相關(guān)（Vuilleumier etal, 2010aandb,supra;Kelleretal, 2012,supra)，在患有頸動脈重度狹窄的病 人中，其與增加的動脈粥樣硬化斑塊易損性相關(guān)（Montecuccoetal, 2011，Eur.Heart J.32:412 - 421)。最后，在近期的一個面對面的比較研宄中，顯示抗-ApoA-IIgG自身 抗體是對于MI之后的CV預(yù)后的最佳的自身體液免疫標記物（Vuilleumier, 2011，J. Clinic.Experiment.Cardiology. 2:69)，是為RA病人中的CV風(fēng)險分層提供對傳統(tǒng)心血 管風(fēng)險因子的增多的預(yù)后信息的唯一生物標記物（Finckhetal, 2012,ArthritisCare Res(Hoboken)64:817 - 825)。
[0004] 從病理生理學(xué)的角度上看，通過當(dāng)將其施用給ApoE缺陷性小鼠時，其增大動脈粥 樣硬化斑塊尺寸和易損性已顯示了抗-ApoA-IIgG自身抗體是動脈粥樣化形成和相關(guān)并發(fā) 癥的潛在介體（Montecuccoetal, 2011，supra)。盡管這些導(dǎo)致動脈粥樣化的效果沒有被 完全了解，但是有證據(jù)表明它們在幾個不同層面上協(xié)同作用。抗-ApoA-IIgG自身抗體已 顯示出（i)抑制高密度脂蛋白的抗動脈粥樣硬化效果（Batucaetal, 2009,Rheumatology (0xford)48:26 - 31)，（ii)通過Toll樣受體2/0)14復(fù)合體來促進無菌性炎癥（Paganoet al，2012,JInternMed. 1365-2796)，（iii)通過L型鈣通道的鹽皮質(zhì)激素受體下游激活來 作為致心律失常因子起作用（Rossieretal, 2012,Endocrinology153:1269 - 1278)，以 及（iv)促進中性粒細胞趨化性（Montecuccoetal, 2011，supra)。
[0005] 已研發(fā)出用于心血管失調(diào)的預(yù)后/診斷的方法，其基于對抗-ApoA-IIgG自身 抗體在主體中的存在的評估。但是，這些方法一般是基于所述抗體和全長ApoA-I之間 的免疫反應(yīng)(Dinuetal, 1998,supra；Vuilleumieretal, 2010a,supra；Kelleret al, 2012,supra,Montecuccoetal, 2011，supra;Batucaetal, 2009,supra)。在這樣的診 斷學(xué)免疫測試中使用全長ApoA-I的主要局限涉及蛋白的大量生產(chǎn)的費用和其不穩(wěn)定性， 這危及測試的效率。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中預(yù)后/診斷方法的問題，本發(fā)明提供了一種基于 肽的新的診斷免疫測試，所述肽的生產(chǎn)更為廉價，其更穩(wěn)定，并且其與來自罹患心血管疾病 的病人的抗-ApoA-IIgG自身抗體特異性連接。本發(fā)明的方法尤其適用于對病人的具體需 求選擇適宜的療法，以及采取行動預(yù)防心血管失調(diào)的發(fā)展，在具有高的心血管風(fēng)險的病人 的亞種群中避免首次或復(fù)發(fā)的心血管事件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在第一個方面，本發(fā)明涉及載脂蛋白A-I(ApoA-I)的表位的模擬肽，其中所述模 擬狀具有：
[0007] (a)長度為15至80個氨基酸的氨基酸序列，
[0008] (b)包括以下任意一種的氨基酸序列：
[0009] (i)SEQIDN0:2,SEQIDN0:3,SEQIDN0:4,SEQIDN0:5,SEQIDN0:21,SEQ IDN0:23，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:9，SEQIDN0:10，SEQID NO:11，SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQID NO: 17,SEQIDNO: 19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24;或其變體，或者
[0010] (ii)與從屬于（i)的序列中的任意一個相同的氨基酸序列，不同之處在于所述 (i)中的序列的1個、2個、3個、4個、5個或6個氨基酸被置換、缺失、插入，和/或化學(xué)修 飾，而不失去所述模擬肽特異性連接抗-ApoA-I抗體的能力，或者
[0011] (iii)從屬于（i)和/或（ii)的兩種氨基酸序列的任意組合；以及
[0012] (c)從屬于b)的氨基酸序列的至少兩種非相鄰氨基酸之間的內(nèi)部交聯(lián)；
[0013] 其中，所述模擬肽能夠特異性地連接抗-ApoA-I抗體。
[0014] 在第二個方面，本發(fā)明涉及載脂蛋白A-I(ApoA-I)的表位的模擬肽，其中所述模 擬狀具有：
[0015] (a)長度為15至80個氨基酸的氨基酸序列，
[0016] (b)包括以下任意一種的氨基酸序列：
[0017] (i)SEQIDN0:5,SEQIDN0:21，SEQIDN0:23 ;或其變體，或者
[0018] (ii)SEQIDNO: 8,SEQIDNO: 9,或者SEQIDNO: 25 ;或其變體，或者
[0019] (iii)與從屬于（i)和/或（ii)的任意一個序列相同的氨基酸序列，不同之處在 于所述（iii)中的序列的1個、2個、3個、4個、5個或6個氨基酸被置換、缺失、插入，和/ 或化學(xué)修飾，而不失去所述模擬肽特異性連接抗-ApoA-I抗體的能力，或者
[0020] (iv)從屬于⑴、（ii)和/或（iii)的兩種氨基酸序列的任意組合；其中，所述模 擬肽能夠特異性地連接抗-ApoA-I抗體。
[0021] 本發(fā)明的第三方面涉及編碼所述模擬肽的分離的多核苷酸、包括所述多核苷酸的 重組載體、包括所述重組載體的宿主細胞，以及用于制備所述模擬肽的方法，其包括在培養(yǎng) 基中培養(yǎng)所述宿主細胞和將所述肽從培養(yǎng)基中或在宿主細胞裂解之后從宿主細胞裂解液 中分離，以及任選地將通過二硫橋、內(nèi)酰胺橋或徑連接（hydrocarbonstaple)獲得的肽的 兩個非相鄰的氨基酸殘基交聯(lián)的步驟。
[0022] 本發(fā)明的第四方面涉及診斷組合物、免疫測定制劑或免疫測試板，其包括至少一 種根據(jù)本發(fā)明的模擬肽。
[0023] 在第五方面，本發(fā)明提供一種包括至少一種根據(jù)本發(fā)明的模擬肽的藥物組合物。
[0024] 在第六方面，本發(fā)明涉及一種用于在生物流體樣本中檢測抗-ApoA-I抗體作為心 血管疾病的生物標記物的試劑盒，其包括至少一種根據(jù)本發(fā)明的模擬肽或其組合。
[0025] 本發(fā)明的第七方面涉及一種用于在哺乳動物主體的生物流體樣本中檢測內(nèi)源性 抗-ApoA-IIgG抗體的方法，其包括以下步驟：
[0026] (a)提供來自哺乳動物主體的生物流體樣本；
[0027] (b)使所述生物流體樣本與固體基質(zhì)接觸，其中至少一種根據(jù)本發(fā)明的模擬 肽被偶聯(lián)至所述固體基質(zhì)，其中，所述接觸是在足以使得在所述生物流體樣