用于非洗提樣品的一步法核酸擴(kuò)增的方法
【專利說(shuō)明】用于非洗提樣品的一步法核酸擴(kuò)增的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的領(lǐng)域，特別是使用聚合酶鏈反應(yīng)以擴(kuò)增核酸。本發(fā)明提供 方法和試劑盒，其可用于按如下擴(kuò)增核酸：將FTA?Elute固體支持物與PCR試劑組合用于 核酸樣品的一步法擴(kuò)增。本發(fā)明在核酸的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和便于加工中具有應(yīng)用并且尤其在基因 分型、診斷學(xué)和法醫(yī)學(xué)中是有用的。
[0002] 背景 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)是在分子生物學(xué)中用于擴(kuò)增核酸的常用工具。US4683202 (Mullis,CetusCorporation)描述了用于擴(kuò)增包含于核酸或其混合物中的任何所需的特 定核酸序列的方法。
[0003] 在濾紙或化學(xué)改性的基質(zhì)上的核酸的長(zhǎng)期儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)移和存檔是用于在將DNA或 RNA以用于遺傳分析（例如PCR)的形式提取和分離之前保藏遺傳材料的周知的技術(shù)。因 此，EP1563091 (Smith等人，Whatman)涉及用于儲(chǔ)存來(lái)自樣品（例如細(xì)胞或細(xì)胞裂解物） 的核酸的方法。將核酸分離并在室內(nèi)溫度和濕度下，在種類廣泛的濾器和其它類型的固體 支持物或固相介質(zhì)上長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。此外，該文件描述了用于在管、柱或多孔板中的寬泛范圍 的固體支持基質(zhì)上儲(chǔ)存含核酸的樣品的方法。
[0004]W0/9003959(Burgoyne)描述了用于儲(chǔ)存DNA(包括血液DNA)的基于纖維素的固 體支持物，其包括具有化合物或組合物的固體基質(zhì)，所述化合物或組合物保護(hù)摻入基質(zhì)中 或吸收到基質(zhì)上的DNA免于降解。此文件也公開(kāi)了用于使用固體介質(zhì)儲(chǔ)存DNA和用于DNA 的回收或DNA的原位使用的方法。
[0005]US5496562(Burgoyne)描述了用于DNA儲(chǔ)存的基于纖維素的固體介質(zhì)和方法。公 開(kāi)了用于將DNA存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)移至固體介質(zhì)上的方法和涉及（a)從固體介質(zhì)中回收DNA或（b) 原位在固體介質(zhì)上使用DNA(例如，通過(guò)PCR的DNA序列擴(kuò)增）的方法。不幸的是，所描述 的方法僅將表面活性劑或去垢劑摻入至固體介質(zhì)的表面上并因此受累于缺點(diǎn)：它們需要分 離步驟用于在實(shí)施PCR之前除去去垢劑。
[0006]W0993900 (Gentra)也描述了用于加工和擴(kuò)增DNA的方法。該方法包括將含DNA 的樣品與固體支持物接觸的步驟，其中裂解試劑被結(jié)合至固體支持物。隨后將所述DNA用 DNA純化試劑處理并純化。該申請(qǐng)?jiān)诠腆w支持物上不包含多價(jià)螯合劑并且需要分離步驟用 于在擴(kuò)增之前除去裂解試劑和純化DNA。
[0007] W09639813 (Burgoyne)描述了用于儲(chǔ)存遺傳材料的樣品和隨后的分析的固體介 質(zhì)；所述固體介質(zhì)包含蛋白變性劑和螯合劑。所述方法是關(guān)于螯合劑的，所述螯合劑為任何 能夠絡(luò)合多價(jià)離子（其包括II族和III族多價(jià)金屬離子和過(guò)度金屬離子）的化合物。該發(fā)明 并沒(méi)有具體提及環(huán)糊精作為螯合劑，它也并沒(méi)提出可按一步法實(shí)施PCR分析。
[0008]US5705345 (Lundin等人）描述核酸制備的方法，其中將含細(xì)胞樣品裂解以釋放 核酸并且用環(huán)糊精處理該樣品以中和提取劑。此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：傳統(tǒng)去垢劑的去除需要分 離步驟，但在加入環(huán)糊精中和去垢劑的情況下會(huì)除去了所需的分離步驟并減少了污染的機(jī) 會(huì)。
[0009] GB2346370(CambridgeMolecularTechnologiesLtd)描述了將包含細(xì)胞（其含 核酸）的樣品應(yīng)用至濾器上，所述細(xì)胞被濾器保留而污染并沒(méi)被保留。將所述細(xì)胞在濾器 上裂解并與核酸一起保留。后續(xù)步驟滲除細(xì)胞裂解物同時(shí)保留核酸。
[0010] W09618731 (Deggerdal)描述了分離核酸的方法，其中將所述樣品結(jié)合至固體支 持物上并且將樣品與去垢劑接觸并實(shí)施后續(xù)步驟以分離核酸。
[0011] W00053807 (Smith,Whatman)描述了用于儲(chǔ)存和裂解含遺傳材料（其可被洗提和 分析）的樣品的介質(zhì)。所述介質(zhì)用裂解試劑涂層。此外，所述介質(zhì)可用弱堿、螯合劑、表面 活性劑和任選尿酸涂層。
[0012] W09938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述帶有結(jié)合的裂解試劑的固體支 持物。所述裂解試劑可包含去垢劑、螯合劑、水和任選RNA消化酶。所述固體支持物并不含 環(huán)糊精并且需要另外的步驟用于純化用于擴(kuò)增分析的核酸。
[0013] 當(dāng)前用于DNA擴(kuò)增的方法包括DNA純化步驟，其常常包括幾個(gè)步驟，這增加了污染 的機(jī)會(huì)。這是煩人的過(guò)程而且現(xiàn)有技術(shù)方法具有在花費(fèi)、復(fù)雜性以及特別是用戶時(shí)間方面 的多個(gè)明顯缺點(diǎn)。例如，基于柱的核酸純化是用以純化核酸的典型的固相提取方法。此方 法依賴于通過(guò)對(duì)二氧化硅或其它支持物的吸附（其取決于緩沖液的pH和鹽含量）的核酸 結(jié)合。合適的緩沖液的實(shí)例包括Tris-EDTA(TE)緩沖液或磷酸鹽緩沖液（由于反應(yīng)性胺 而在DNA微陣列實(shí)驗(yàn)中使用）。在這類旋轉(zhuǎn)柱（spincolumn)上的核酸的純化包括許多復(fù) 雜和煩人的步驟。在旋轉(zhuǎn)柱上的核酸純化通常包含三個(gè)耗時(shí)和復(fù)雜的步驟/階段： 將含核酸的樣品加入柱，并且核酸由于結(jié)合緩沖液的較低的pH(相對(duì)于柱上的硅烷 醇基團(tuán)）和鹽濃度而結(jié)合，所述結(jié)合緩沖液可含緩沖液、變性劑（例如鹽酸胍）、Triton X-100、異丙醇和pH指不劑； 用5mMKP04pH8. 0或類似物，80%EtOH洗滌該柱；和 用緩沖液或水洗提該柱。
[0014] 備選的方法涉及在離液鹽的存在下的核酸結(jié)合，使得DNA結(jié)合至二氧化硅或玻璃 顆?；虿Ａе?。此性質(zhì)被用于在堿性條件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠純化核酸。典型的 離液鹽包括硫氰酸胍fS或鹽酸胍鶴并且最近玻璃珠已經(jīng)用含玻璃的微柱取代。
[0015] 在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中針對(duì)PCR擴(kuò)增失敗的最好的防備在于將可靠的樣品處理和加工 技術(shù)與經(jīng)證明有效純化DNA的提取系統(tǒng)組合。
[0016] SantosC.R?等人，（BrazilianJournalofMicrobiology, 2012，43， 389-392)描述了跳過(guò)在核酸的PCR擴(kuò)增之前的洗提步驟和將沖壓片（puncher)直接加入 PCR混合物的方法。該P(yáng)CR擴(kuò)增被實(shí)施用于檢測(cè)HPV-DNA并且與在擴(kuò)增之前洗提核酸的標(biāo) 準(zhǔn)的FTA洗提卡（FTAelutecard)方案相比更有效。然而此方法僅使用定性PCR測(cè)量HPV 的存在。
[0017] NozawaN?等人，（JournalofClinicalMicrobiology, 2007，45， 1305-1307)描述了將實(shí)時(shí)PCR用于檢測(cè)巨細(xì)胞病毒（CMV)的方法。所述方法涉及帶有純化 的CMV的濾紙的使用和將其直接加入PCR混合物。所述論文指出只有具有光電倍增管掃描 系統(tǒng)的儀器可用于使用濾片的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。所述論文提出濾紙會(huì)不利地影響使用電荷耦 合器件相機(jī)的儀器并由此教導(dǎo)避免在諸如ABI7700機(jī)器等實(shí)時(shí)PCR機(jī)器中使用濾紙。
[0018] QiagenSample&AssayTechnologiesNewsletter(2010 年 3 月，15)描述了 在RNA制劑中低A26Q/A23Q比率對(duì)下游PCR處理的作用。該報(bào)道指出在RNA樣品中在230nm處增加的吸光度相當(dāng)經(jīng)常是因硫氰酸胍（FTA洗提卡的組分并用于RNA純化方法）的污染 所致。該實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)硫氰酸胍存在時(shí)RNA樣品的A26(l/A23(l比率較低，但是在RNA樣品中多至 lOOmM的硫氰酸胍濃度不影響實(shí)時(shí)PCR的可靠性。
[0019] 通常包含于所述標(biāo)準(zhǔn)FTA洗提卡方案中的純化步驟可以是麻煩的并且純化可導(dǎo) 致DNA的損失。因此有對(duì)用于對(duì)核酸擴(kuò)增、定量和/或概況分析的改良和簡(jiǎn)化的方法的需 要，所述方法除去了對(duì)純化步驟的需要。本發(fā)明致力于此問(wèn)題并提供方法和試劑盒，其可用 于來(lái)自固體支持物，特別是纖維素衍生的支持物的核酸的單一步驟擴(kuò)增。
[0020] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于便于擴(kuò)增DNA樣品的方法和試劑盒，其可被用于按如下擴(kuò)增核酸：將 固體支持物與核酸接觸并在所述固體支持物存在下擴(kuò)增核酸。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了用于擴(kuò)增核酸的方法，其包含以下步驟： i) 將包含離液鹽的固體支持物與含核酸的細(xì)胞樣品接觸， ii) 將所述固體支持物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器， iii) 將在固體支持物上的所述核酸與核酸擴(kuò)增試劑溶液一起孵育， iv) 擴(kuò)增所述核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸， v) 定量擴(kuò)增的核酸和任選地， vi) 使用短串聯(lián)重復(fù)（STR)概況分析以產(chǎn)生STR分布圖， 其中步驟i)_vi)在固體支持物的存在下實(shí)施。
[0022] 在固體支持物的存在下擴(kuò)增核酸的優(yōu)點(diǎn)在于減少核酸擴(kuò)增所需的步驟數(shù)量，從而 節(jié)約操作員時(shí)間和方便操作員使用。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，其中所述固體支持物在加入所述細(xì)胞樣品之前已經(jīng)在反 應(yīng)容器中。
[0024] 在另一方面中，擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)。
[0025] 在另一方面中，擴(kuò)增方法包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、等溫?cái)U(kuò)增或定量聚合酶鏈反 應(yīng)。
[0026] 在進(jìn)一步的方面中，所述核酸擴(kuò)增試劑溶液包含聚合酶、脫氧核糖核苷酸三磷酸 (dNTP)、反應(yīng)緩沖液和至少一種引物，其中所述引物任選用染料標(biāo)記。這類染料可包括來(lái) 自GEHealthcare的熒光染料FAM? 或CyDyeDIGEFluor? (產(chǎn)品代碼RP