阿洛酮糖差向異構(gòu)酶及使用其的用于轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑慕M合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來自原始介屬密螺旋體（Treponemaprimitia)的阿洛酮糖3-差向異 構(gòu)酶、使用其的用于轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑慕M合物及阿洛酮糖生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] D-阿洛酮糖（D-psicose)是果糖（fructose)的第3個碳的差向異構(gòu)體（epimer)， 當與砂糖進行比較時，具有70%的甜度（Oshima2006)，但能量僅為0.3%，因此是能夠用 作減肥食品的低卡路里甜味料的功能性單糖類（Matsuoetal. 2002)。此外，由于具有通過 抑制葡萄糖的吸收來起到抑制血糖的作用的功能，因此能夠應(yīng)用于糖尿病患者用飲食品、 瘦身用飲食品等；由于具有抑制肝中的脂質(zhì)合成有關(guān)的酶活性的功能，因此能夠抑制腹部 脂肪堆積，從而用于健康食品等各種各樣的功能性食品等（Matsuo等人，2001 ;lida等人， 2008;Hayashi等人，2010;Hossain等人 2011)。
[0003] 由于上述特征，阿洛酮糖是能夠代替砂糖的優(yōu)選的原料，但由于阿洛酮糖屬于自 然界中極少存在的單糖類稀有糖，因此為了應(yīng)用于食品工業(yè)，需要有效生產(chǎn)阿洛酮糖的方 法。作為以往的阿洛酮糖生產(chǎn)方法，主要經(jīng)由化學過程來生產(chǎn)。Bilik等人提出利用鉬酸離 子的催化劑作用使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑姆椒?。麥當勞（McDonald)從1，2:4, 5-二-異 亞丙基 _ 0 _D_ 吡喃果糖（1，2:4, 5di_。-isopropylidene-beta-D-fructopyranose)通過 3步化學處理工序生產(chǎn)了阿洛酮糖。此外，Doner將果糖與乙醇和三乙胺一同加熱生產(chǎn)了阿 洛酮糖。然而，它們的化學生產(chǎn)方法存在消耗大量費用、效率低且產(chǎn)生大量副產(chǎn)物這樣的缺 點。
[0004] 作為生物學阿洛酮糖生產(chǎn)方法，提出了利用微生物的細胞反應(yīng)從半乳糖醇 (galactitol)、D-塔格糖或D-塔羅糖醇等生產(chǎn)阿洛酮糖的方法（KenIzumori)。但該方 法由于基質(zhì)屬于稀有糖，因此難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。工業(yè)化中最有效的方法是在D-酮糖 3_差向異構(gòu)酶群中尋找使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑拿傅姆椒āＴ谝酝_的內(nèi)容中，將來自 解纖維梭菌H(10) (Mu等人，2011)、根癌農(nóng)桿菌（Kim等人，2006)、菊苣假單胞菌（Itoh等 人，1994)、球體根瘤菌（Zhang等人，2009)的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶插入大腸桿菌并使 之轉(zhuǎn)化后，使用在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中表達的D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶，從果糖生產(chǎn)了阿洛酮 糖。
[0005] 然而，根據(jù)以往的揭示了功能的酶的方法，生產(chǎn)阿洛酮糖的方法在中溫和堿性條 件的pH下表現(xiàn)出最佳。由于堿性條件下的反應(yīng)誘導(dǎo)非特異性反應(yīng)和糖褐變，因此不適合工 業(yè)化。此外，以往的酶存在如下問題：由于高溫下穩(wěn)定性降低或反應(yīng)速度慢方面的原因，具 有使應(yīng)用于工業(yè)化的阿洛酮糖生產(chǎn)的制造成本上升的因素。因此，需要開發(fā)阿洛酮糖的生 產(chǎn)收率、溫度、pH和反應(yīng)速度均適合工業(yè)化的新穎的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 所要解決的課題
[0007] 由此，本發(fā)明的課題是，提供一種具有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白、對 其進行編碼的基因及使用其來生產(chǎn)阿洛酮糖的新方法，所述D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活 性的蛋白為以往未揭示功能的蛋白質(zhì)，具有在工業(yè)反應(yīng)容易的溫度（約50~60°C)下反應(yīng) 速度快、穩(wěn)定性優(yōu)異的特性，因此適合應(yīng)用于阿洛酮糖工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。
[0008] 解決課題的方法
[0009] 本發(fā)明人在目前為止未揭示功能的多核苷酸中與根癌農(nóng)桿菌或類球紅細菌的催 化劑活性殘基一致，但全部氨基酸序列有40-60%左右的同源性的屬于非病原性瘤胃球 菌屬、梭菌屬、密螺旋體屬、副球菌屬、Citreicella屬、中華根瘤菌屬的微生物中，對酮糖 3_差向異構(gòu)酶的活性進行篩選，其結(jié)果是，最初揭示了在其中的原始介屬密螺旋體ZAS-1 所具有的基因中對能夠?qū)⒐寝D(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑拿高M行表達的多核苷酸，由此，為了進行 穩(wěn)定的蛋白質(zhì)過表達，合成最佳的多核苷酸序列，將其插入特定載體并表達，從而確認了具 有高效將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚缘拿浮?br>[0010] 此外，在以帶有電荷的酸性氨基酸和/或堿性氨基酸取代在上述酶的特征位置不 存在電荷的氣基酸的情況下，本發(fā)明人能夠制造在保持上述酶的原有活性的同時具有尚表 達率、特別地表達為水溶性蛋白質(zhì)的提尚效率的蛋白質(zhì)變異體。
[0011] 以下，更詳細說明本發(fā)明。
[0012] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式是，提供一種D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶蛋白，其具有 序列號1的氨基酸序列或者與上述序列號1的氨基酸序列有70%以上同源性的氨基酸序 列。
[0013]上述酶蛋白優(yōu)選來自原始介屬密螺旋體（Treponemaprimitia)，更優(yōu)選來自原始 介屬密螺旋體（Treponemaprimitia)ZAS_l〇
[0014] 就上述酶而言，未知其生物化學功能，僅以堿基序列的特性，將其命名為木糖異構(gòu) 酶，但在對具有將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑幕钚缘拿高M行篩選時發(fā)現(xiàn)，上述酶具有使果糖的 第3個碳位引起差向異構(gòu)化反應(yīng)、使其轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑墓δ堋?br>[0015] 因此，優(yōu)選地，上述酶蛋白可以通過對果糖的第3位碳進行差向異構(gòu)化來將果糖 轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋恰?br>[0016] 上述酶蛋白優(yōu)選可以具有序列號1的氨基酸序列，但只要能夠保持使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)?阿洛酮糖的活性，就不受此限制，包括序列號1的氨基酸中一部分被取代、插入或缺失等全 部情況。優(yōu)選包含具有與上述序列號1的氨基酸序列有70%以上、更優(yōu)選有80%以上、進 一步優(yōu)選有90%以上同源性的氨基酸序列的氨基酸序列。這樣的同源性的比較可以利用市 售的電腦程序以百分比（％ )計算2個以上的序列間的同源性來實施。
[0017] 就具有與上述序列號1的氨基酸序列有70%以上同源性的氨基酸序列的酶蛋白 而言，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE)測定的單體的分子量可以 為32至34千道爾頓（kDa)，最佳溫度為50至65°C，優(yōu)選其是在pH7、ImMCo2+離子存在下 進行5分鐘反應(yīng)時測定的值，但不限于此。此外，就上述酶蛋白的最佳pH而言，最佳pH可 以為6. 0至9. 0,其是在60°C、ImMCo2+離子的存在下進行5分鐘反應(yīng)時測定的值，但不限 于此。具有根據(jù)上述序列號1至4中任一序列號的氨基酸序列的酶蛋白可以擁有下述特征 中的一種以上：
[0018] (a)單體的分子量為32至34kDa、
[0019] (b)最佳溫度為50至65 °C、及
[0020] (c)最佳pH為 6. 0 至 9. 0。
[0021] 此外，上述酶蛋白具有借助金屬離子來調(diào)節(jié)活性的特性，優(yōu)選選自由錳和鈷組成 的組中的1種以上的金屬離子，更優(yōu)選可以借助Mn2+和/或Co2+離子增加活性。
[0022] 本發(fā)明的另一實施方式是，提供一種酶蛋白變異體，其作為具有與具有上述序列 號1的氨基酸序列有70%以上的同源性的氨基酸序列的酶蛋白的一個例子，是在酶蛋白的 特征位置誘發(fā)定點突變（site-directedmutagenesis)而制造的。就這樣的酶變異體而 言，其最佳溫度優(yōu)選在pH7、lmMCo2+離子的存在下進行5分鐘反應(yīng)時為50至65°C。此外， 不僅滿足在60°C、ImMCo2+離子的存在下進行5分鐘反應(yīng)時最佳pH為6. 0至9. 0的特性， 而且具有提尚向水溶性蛋白質(zhì)的表達率的特性。
[0023] 上述酶變異體的優(yōu)選的例子可以是選自由具有序列號1的氨基酸序列的第229個 氨基酸和第264個氨基酸組成的組中的1種以上的氨基酸被選自由賴氨酸、精氨酸、組氨 酸、天冬氨酸和谷氨酸組成的組中的1種以上的氨基酸取代的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 蛋白。
[0024] 更優(yōu)選地，選自由具有序列號1的氨基酸序列的第229個氨基酸和第264個氨基 酸組成的組中的1種以上的氨基酸被選自由天冬氨酸和谷氨酸組成的組中的1種以上的氨 基酸取代。具體的酶變異體的例子是，具有序列號1的氨基酸序列的第229個氨基酸被谷 氨酸取代的蛋白質(zhì)（A229E單一變異體）、第264個氨基酸被天冬氨酸取代的蛋白質(zhì)（N264D 單一變異體）、或氨基酸序列的第229個氨基酸被谷氨酸取代且第264個氨基酸被天冬氨 酸取代的酶蛋白（A229E/N264D雙重變異體）。A229E單一變異體具有序列號3的氨基酸序 列，N264D單一變異體具有序列號3的氨基酸序列，A229E/N264D雙重變異體具有序列號4。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)選的另一實施方式是，提供一種用于將果糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒙逋堑慕M合 物，其含有對上述序列號1至序列號4中任一氨基酸序列進行編碼的基因或者包含上述基 因的重組載體作為有效成分。
[0026] 上述基因解釋為：優(yōu)選具有具有序列號5的堿基序列，但也包含對于上述堿基序 列表現(xiàn)出實質(zhì)相同的序列。此外，作為對上述變異酶蛋白進行編碼的基因，對序列號2的氨 基酸序列進行編碼