一種基于親水固相萃取技術(shù)的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物類分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的類分離純化，具體地說(shuō)是一種新型的親水固 相萃取柱（ClickXIon)聯(lián)合高效液相色譜選擇性類分離贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的純化制 備方法。該方法對(duì)氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類化合物和非氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類 化合物表現(xiàn)出較優(yōu)的分離效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 贍餘二帰內(nèi)醋（bufadienolides)是一類C24留，并且在留體母核的C17位接有 目六元不飽和內(nèi)醋環(huán)，該類化合物也常被稱為贍餘二帰內(nèi)醋。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分別對(duì)贍餘二帰內(nèi)醋類化合物具有的生物活性進(jìn)行了綜述。該些 活性主要包括局麻、強(qiáng)也、升壓、NaVr-ATP酶抑制活性及抗腫瘤等作用（L.Krenn，B. Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry, 48(1998) 1-29. ；P.S.Steyn,FanieR.vanHeerden,Bufadienolidesofplantandanimalorigin,Nat. Prod.Rep, 15 (1998) 397-413. ；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolidesand theirantitumoractivity,P^Jat-Procl.R巧.，28(2011)953-969.)。另外，此類贍餘二帰內(nèi) 醋類成分中的許多化合物都具有較高的毒性和較嚴(yán)重的副作用，給使用者帶來(lái)一定的安全 隱患，從而制約了此類制劑的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,QiemicalConsti1:uents andBioactivitiesoftheSkinofBufobufogargarizansCantor,Chem. Biodivers. ,8(2011)559-567.)。從天然產(chǎn)物(贍餘皮、贍酥)中分離純化是獲得贍餘二帰內(nèi) 醋單體的主要途徑。由于贍餘二帰內(nèi)醋類化合物數(shù)量多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常規(guī)的分離純化方法較 為耗時(shí)、低效（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phyto chemistry, 48 (1998) 1-29.)。由于氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋和非氨基酸修飾的贍餘二帰 內(nèi)醋類化合物疏水性相似，在反相高效液相純化制備時(shí)常常出現(xiàn)共流出現(xiàn)象，給分離純化 帶來(lái)一定的困難。因此，發(fā)展較為高效的方法從贍餘皮中分離出高純度的贍餘二帰內(nèi)醋類 化合物進(jìn)而開展相關(guān)藥理毒理方面的研究是十分迫切的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種基于親水固相萃取技術(shù)的贍餘二帰內(nèi)醋類化合物類分離純化 方法。
[0004] 基于親水條件下，氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類化合物和非氨基酸修飾的贍餘二 帰內(nèi)醋類化合物親水性質(zhì)的不同，我們采用親水固相萃取柱聯(lián)合半制備反相色譜柱發(fā)展了 一種選擇性類分離贍餘二帰內(nèi)醋類化合物的純化方法。其中所述親水色譜柱為兩性離子柱 (ClickXIon，北京華譜新創(chuàng)科技有限公司）。流動(dòng)相組成為己膳、甲醇、己醇、甲酸、己酸、H 氣己酸、水。采用線性梯度、臺(tái)階梯度或等度洗脫方式。選取贍餘皮95%己醇提取物反相色 譜制備分離所得的一個(gè)觸分，采用ClickXIon親水固相萃取柱分成氨基酸修飾的贍餘二帰 內(nèi)醋類組分和非氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋類組分，通過(guò)反相色譜對(duì)兩組分分別制備，共 獲得走個(gè)化合物，其中兩個(gè)為氨基酸修飾的贍餘二帰內(nèi)醋，另外五個(gè)為非氨基酸修飾的贍 餘二帰內(nèi)醋。所述化合物的結(jié)構(gòu)信息見式1、表1。
[0005]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物選擇性分離的純化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，水（A)和甲醇（B)流動(dòng)相體系；洗脫梯度 為體積濃度25% - 100%B(v/v);按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，每個(gè)組分濃縮至 干后備用； 2) 針對(duì)富含蟾蜍二烯內(nèi)酯的組分F14,分離過(guò)程中F14組分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體 積濃度為58. 3%-59. 6% ;采用ClickXIon親水固相萃取柱對(duì)兩類化合物進(jìn)行類分離，固相 萃取條件：親水固相萃取柱為兩性離子固相萃取柱（ClickXI〇n，20g/60mL);淋洗條件為： 淋洗I:95% (v/v)乙腈-水或乙醇-水80mL，回收溶劑得F14-F1 ;淋洗2 :50% (v/v)乙 腈-甲酸水或乙醇-甲酸水80mL，（酸水體積濃度為0. 1%-0. 5%)回收溶劑得F14-F2 ; 3) 針對(duì)F14-F1和F14-F2,采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備，色譜柱為XCharge C18柱；采用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液流動(dòng)相體系，對(duì)蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物進(jìn)行選擇 性地分離。
2. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：固相萃取柱為含兩 性離子的親水固相萃取柱（ClickXIon)，采用臺(tái)階等度洗脫方式，對(duì)氨基酸修飾的蟾蜍二 烯內(nèi)酯類化合物和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物進(jìn)行類分離。
3. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯類分離方法，其特征在于：固相萃取操作參數(shù)如 下：色譜柱內(nèi)徑為IO-1000 mm;采用體積濃度85%-100%乙醇-水溶解或體積濃度90%-100% 甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上樣濃度為ImgAir1-IgAiL;上樣量為lmL-400mL;流 速為 5-1000mL/min。
4. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：色譜操作參數(shù)如下： 色譜柱內(nèi)徑為4. 6-100mm;采用體積濃度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上 樣濃度為lmg/mL-i-lg/mL;進(jìn)樣量為IiiL-40mL;流速為l-480mL/min;柱溫為 10-60°C。
5. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯固相萃取類分離方法，其特征在于：所述洗脫溶 劑流動(dòng)相組成為乙臆_水或乙醇 -水體系。
6. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述流動(dòng)相組成為 乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水。
7. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物 為50%-95% (V/V)乙醇回流提取物。
8. 按照權(quán)利要求1所述蟾蜍二烯內(nèi)酯分離純化方法，其特征在于： 1)蟾蜍皮50%-95% (V/V)乙醇提取物先經(jīng)制備型RPLC分離，色譜條件：色譜 柱為碳十八柱（C18TDE柱）；水（A)和甲醇（B)流動(dòng)相體系；洗脫梯度為0-7min， 體積濃度25% - 40%B; 7-60min,體積濃度40% - 65%B; 60-65min,體積濃度 65% - 100%B;65-75min, 100%B;流速為330mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm;其采用體積濃度65% 甲醇-水溶解，樣品溶液濃度為440mg/mL，其采用體積濃度65%甲醇-水溶解；進(jìn)樣體積 為40mL;按各色譜峰的保留時(shí)間分別收集各餾分，共計(jì)22個(gè)組分，每個(gè)組分濃縮至干后備 用；針對(duì)組分F14 (分離過(guò)程中F14組分對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相中甲醇的體積濃度為58. 3%-59. 6%)， 采用含兩性離子的ClickXIon親水固相萃取柱臺(tái)階等度洗脫方式實(shí)現(xiàn)了蟾蜍二烯內(nèi)酯類 化合物的類分離，通過(guò)半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)純化制備，色譜柱為XChargeC18柱；采用乙 腈-水流動(dòng)相體系，采用線性梯度洗脫方式制備蟾蜍二烯內(nèi)酯單體化合物； 2) 選取組分F14采用ClickXIon親水固相萃取柱對(duì)兩類化合物進(jìn)行類分離，固相萃取 條件：親水固相萃取柱為兩性離子固相萃取柱（ClickXI〇n，20g/60mL);淋洗條件為：淋洗 I:95% (V/V)乙腈-水或95% (V/V)乙醇-水80mL，回收溶劑得F14-F1;淋洗2 :50% (v/ v)乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水(酸水體積濃度為0.l%-0. 5%) 80mL，回收溶劑得F14-F2 ; 3) 選取組分F14-F1和F14-F2,采用半制備反相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離，色譜條件：色譜 柱為半制備反相色譜柱（XChargeC18, 250X20mm，i.d.，5iim);水（A)和乙腈（B)流動(dòng)相體 系；流速為19mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm;進(jìn)樣次數(shù)：3 ;進(jìn)樣量為2mL;按各色譜峰的保留時(shí) 間分別收集各餾分，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實(shí)驗(yàn)確定，獲得1-7七個(gè)化合物； 通過(guò)反相色譜制備獲得兩類八個(gè)高純度蟾蜍二烯內(nèi)酯化合物；所述兩類化合物分別為 兩個(gè)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物：化合物1為沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合 物2為遠(yuǎn)華蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，五個(gè)非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯：化合物3為遠(yuǎn) 華蟾毒精，化合物4為乙酰華蟾毒精，化合物5為乙酰華蟾毒精，化合物6為蟾蜍它靈，化 合物7為蟾蜍靈。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于親水固相萃取技術(shù)的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物類分離純化方法。采用鍵合兩性離子基團(tuán)的Click XIon親水固相萃取柱聯(lián)合半制備反相色譜柱選擇性類分離蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的純化方法。選取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色譜制備分離所得的一個(gè)餾分，采用Click Xion親水固相萃取柱分成氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類組分和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類組分，通過(guò)反相色譜對(duì)兩組分分別制備，共獲得七個(gè)化合物。該方法可以實(shí)現(xiàn)氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類和非氨基酸修飾的蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物的類分離及高效制備，解決了兩類化合物在反相柱上疏水性相似，洗脫窗口窄的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了類分離，并表現(xiàn)出較好的分離效果。
【IPC分類】C07J71-00, C07J19-00, C07J41-00
【公開號(hào)】CN104774235
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410010818
【發(fā)明人】梁鑫淼, 李曉龍, 劉艷芳, 張?jiān)? 張秀莉, 肖遠(yuǎn)勝
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2014年1月9日