一種重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重樓的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]重樓是名貴中藥材之一，其主要有效成分是留體皂苷?，F(xiàn)代藥理研宄表明，重樓具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的療效已被眾多的制藥工業(yè)用于藥劑的使用，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分。
[0003]隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，重樓藥材的需求正以每年20%的幅度遞增，而其野生資源卻逐年減少，導(dǎo)致重樓價(jià)格迅速上漲，嚴(yán)重制約了制藥企業(yè)的產(chǎn)量和質(zhì)量。當(dāng)前，重樓主要靠采挖野生資源，由于長(zhǎng)期過(guò)度采挖，并缺乏對(duì)其生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現(xiàn)己瀕臨滅絕。
[0004]目前重樓主要是靠種子和根莖進(jìn)行繁殖，由于重樓種子存在種胚發(fā)育不完全，胚乳堅(jiān)硬，胚軸后熟等明顯“雙重休眠”特性，因此重樓種子在播種后通常需要經(jīng)歷兩個(gè)冬天才能萌發(fā)成苗，是典型的“ 二年生種子”，而且在自然狀態(tài)下重樓種子出苗率很低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，從出苗到成材需要8-10年的時(shí)間；而使用重樓根莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，由于重樓根莖本身就是其藥用有效部位，因此利用根莖切塊生產(chǎn)重樓種苗存在用種量大、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。
[0005]利用生物工程的懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用植物具有周期短、生長(zhǎng)速度快和工業(yè)上可利用發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。目前還未見(jiàn)任何有關(guān)重樓珠心細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法，該方法能實(shí)現(xiàn)重樓珠心細(xì)胞的快速增殖，以緩解當(dāng)前重樓藥材資源緊缺的問(wèn)題。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案由如下步驟構(gòu)成:
[0008](I)重樓種子的預(yù)處理:選取尚未完全成熟的重樓果實(shí)，去掉果皮后先進(jìn)行浸泡，然后將浸泡后的重樓種子搓去外種皮后，再用升汞溶液進(jìn)行消毒，將消毒后的重樓種子用無(wú)菌水沖洗后，用濾紙吸干內(nèi)種皮表面的水分，再用小刀劃傷重樓種子的內(nèi)種皮，并將劃傷內(nèi)種皮的重樓種子放置一段時(shí)間，使重樓種子內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂，露出大量重樓珠心細(xì)胞；
[0009](2)重樓珠心細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng):取內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂的重樓種子，放在超凈工作臺(tái)上用0.1%的升汞溶液消毒2?4分鐘，用無(wú)菌水沖洗后，用解剖刀切取重樓種子的珠心細(xì)胞接入液體培養(yǎng)基 B5+ 赤霉素 200-600mg/L+KTl.0-3.0mg/L+IAA 0.5-1.5mg/L 中進(jìn)行 25 ?35天的預(yù)培養(yǎng)；
[0010](3)重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):選取預(yù)培養(yǎng)后處于懸浮培養(yǎng)液中部或/和下部的重樓珠心細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊，以40?80g.I/1的接種量轉(zhuǎn)接到B5+6-BA0.5?2.0mg/L+NAA0.5?2.0mg/L+2, 4-D 1.0?3.0mg/L液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；
[0011](4)細(xì)胞的繼代培養(yǎng):在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)了 40?60天進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每隔35?45天繼代一次，每次的接種量為30?60g.L—1;
[0012]上述⑵、(3)、⑷步驟中重樓珠心細(xì)胞的液體培養(yǎng)條件均為溫度20?25°C，pH值5.0?7.0，無(wú)光照，搖床轉(zhuǎn)速為120?180r.mirT1。
[0013]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述浸泡是指用濃度為1/104的高錳酸鉀溶液浸泡24?72小時(shí)。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述用升汞溶液進(jìn)行消毒是指放入濃度為0.01%的升汞溶液中消毒4?7分鐘。
[0015]進(jìn)一步地，步驟(I)中所述將劃傷內(nèi)種皮的重樓種子放置一段時(shí)間是指將劃傷內(nèi)種皮的重樓種子在溫度為25?30°C、光照強(qiáng)度為1500?20001x的條件下放置3?5小時(shí)。
[0016]本發(fā)明通過(guò)對(duì)重樓珠心細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模快速生產(chǎn)出有效成分含量高的重樓細(xì)胞培養(yǎng)物，從而可有效解決當(dāng)前重樓植物資源和藥材資源短缺的問(wèn)題。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018](I)重樓種子的預(yù)處理:選取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重樓果實(shí)，去掉果皮后將帶外種皮的重樓種子用濃度為I/?ο4的高錳酸鉀溶液浸泡24小時(shí)，期間每隔12小時(shí)換高錳酸鉀溶液一次，取出浸泡后的重樓種子，搓去外種皮后，放入濃度為0.01 %的升汞溶液中消毒4分鐘，用無(wú)菌水沖洗2次后，迅速用已消毒的濾紙吸干內(nèi)種皮表面的水分，接著用小刀劃傷重樓種子的內(nèi)種皮，并將劃傷內(nèi)種皮的重樓種子在溫度為25°C、光照強(qiáng)度為15001x的條件下放置3小時(shí)，有89.5%的重樓種子內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂，露出大量結(jié)構(gòu)較松散的重樓珠心細(xì)胞；
[0019](2)重樓珠心細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng):取內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂的重樓種子，放在超凈工作臺(tái)上用0.1%的升汞溶液消毒2分鐘，用無(wú)菌水沖洗后，用解剖刀切取結(jié)構(gòu)較松散的重樓珠心細(xì)胞接入液體培養(yǎng)基B5+赤霉素200mg/L+KTl.0mg/L+IAA 0.5mg/L中進(jìn)行25天的預(yù)培養(yǎng)；
[0020](3)重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):選取預(yù)培養(yǎng)后處于懸浮培養(yǎng)液中部和下部的重樓珠心細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊，以40g.I/1的接種量轉(zhuǎn)接到B5+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2, 4-D1.0mg/L液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；
[0021](4)細(xì)胞的繼代培養(yǎng):在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)了 40天進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每隔35天繼代一次，每次的接種量為30g.L—1;
[0022](5)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)倍數(shù)的計(jì)算:取繼代培養(yǎng)3代的重樓珠心細(xì)胞在3000r/min的離心機(jī)上離心5min后，倒掉上清液進(jìn)行稱(chēng)重，按如下公式計(jì)算出重樓珠心細(xì)胞的增殖倍數(shù)為2.03倍；
[0023]細(xì)胞增殖倍數(shù)=(收獲量鮮重一接種量鮮重)/接種量鮮重；
[0024]上述⑵、(3)、⑷步驟中重樓珠心細(xì)胞的液體培養(yǎng)條件均為溫度20°C，pH值5.0，無(wú)光照，搖床轉(zhuǎn)速為120r.mirT1。
[0025]實(shí)施例2
[0026](I)重樓種子的預(yù)處理:選取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重樓果實(shí)，去掉果皮后將帶外種皮的重樓種子用濃度為I/?ο4的高錳酸鉀溶液浸泡48小時(shí)，期間每隔12小時(shí)換高錳酸鉀溶液一次，取出浸泡后的重樓種子，搓去外種皮后，放入濃度為0.01%的升汞溶液中消毒5分鐘，用無(wú)菌水沖洗3次后，迅速用已消毒的濾紙吸干內(nèi)種皮表面的水分，再用小刀劃傷重樓種子的內(nèi)種皮，并將劃傷內(nèi)種皮的重樓種子在溫度為27°C、光照強(qiáng)度為18001x的條件下放置4小時(shí)，有92%的重樓種子內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂，露出大量重樓珠心細(xì)胞；
[0027](2)重樓珠心細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng):取內(nèi)種皮產(chǎn)生爆裂的重樓種子，放在超凈工作臺(tái)上用0.1%的升汞溶液消毒3分鐘，用無(wú)菌水沖洗5次后，用解剖刀切取結(jié)構(gòu)較松散的重樓珠心細(xì)胞接入液體培養(yǎng)基B5+赤霉素400mg/L+KT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L中進(jìn)行30天的預(yù)培養(yǎng);
[0028](3)重樓珠心細(xì)胞的懸浮培養(yǎng):選取預(yù)培養(yǎng)后處于懸浮培養(yǎng)液中部的重樓珠心細(xì)胞和細(xì)胞小團(tuán)塊，以60g.1/1的接種量轉(zhuǎn)接到B5+6-BA1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+2, 4-D 2.0mg/L液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；
[0029](4)細(xì)胞的繼代培養(yǎng):在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)了 50天進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每隔40天繼代一次，每次的接種量為45g.L—1;
[0030](5)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)倍數(shù)的計(jì)算:取繼代培養(yǎng)3代的重樓珠心細(xì)胞在3000r/min的離心機(jī)上離心5min后，倒掉上清液進(jìn)行稱(chēng)重，按如下公式計(jì)算出重樓珠心細(xì)胞的增殖倍數(shù)為2.48倍；
[0031]細(xì)胞增殖倍數(shù)=(收獲量鮮重一接種量鮮重)/接種量鮮重；
[0032]上述⑵、(3)、⑷步驟中重樓珠心細(xì)胞的液體培養(yǎng)條件均為溫度22°C，pH值6.5，無(wú)光照，搖床轉(zhuǎn)速為150r.m