一種利用聚焦超聲改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)和超聲學(xué)領(lǐng)域，是一種利用超聲技術(shù)改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利用超聲空化效應(yīng)引起細(xì)胞膜聲穿孔從而促進(jìn)藥物在病灶區(qū)的轉(zhuǎn)載與吸收的超聲轉(zhuǎn)染技術(shù)也是目前國內(nèi)外超聲治療領(lǐng)域所關(guān)注的一個重點(diǎn)課題。由于含液體媒質(zhì)或肌肉組織中通常含有很多肉眼不可見的微小氣核或空穴，當(dāng)超聲波在其中傳播且聲壓超過一定閥值時，在聲波的負(fù)聲壓相，這些氣核會發(fā)生膨脹生成空化泡。在超聲作用下，這些空化泡會產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及內(nèi)爆等一系列動力學(xué)過程。目前臨床使用的超聲造影劑是微米量級(1-10微米)的包裹著外膜的微小氣泡。當(dāng)其被作為穩(wěn)定空化核加入進(jìn)入聲場后，可以顯著降低超聲空化閥值，并大幅度增高超聲空化強(qiáng)度。當(dāng)驅(qū)動聲波振幅較大時，可以引發(fā)微泡的非線性瞬態(tài)空化效應(yīng)，聲場能量可以被集中，伴隨空化泡崩潰瞬間，在液體中的極小空間內(nèi)將其高度集中的能量釋放出來，形成高溫、高壓、強(qiáng)沖擊波等物理?xiàng)l件，使處于空化核周圍的組織細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被擊穿，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔(圖2)。較為溫和的穩(wěn)態(tài)空化過程中，由空化泡的周期性振動激發(fā)的聲微流會在細(xì)胞周圍產(chǎn)生梯度速度場，從而對細(xì)胞膜產(chǎn)生剪切應(yīng)力。
[0003]聲微流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力會對細(xì)胞膜產(chǎn)生拉伸作用，使細(xì)胞膜表面出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，促使藥物進(jìn)入細(xì)胞(Hu YT, Qin S，Hu T, Ferrara Kff, JiangQ.Asymmetric oscillat1n of cavitat1n bubbles in a microvessel and itsimplicat1ns upon mechanisms of clinical vessel injury in shock-wavelithotripsy.1ntl J Nonlinear Mech，40:341-350 (2005)) D 但是現(xiàn)有技術(shù)中，改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法無法精確定位，且容易造成細(xì)胞裂解等損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)存在的:(I)無法精確定位；(2)容易造成細(xì)胞裂解；(3)電刺激可能會影響細(xì)胞信道的傳導(dǎo)等問題，本發(fā)明提供了一種利用聚焦超聲改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法。本方法能夠通過超聲的空化效應(yīng)，將細(xì)胞表面的空隙增大。
[0006]2、技術(shù)方案
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0008]一種利用聚焦超聲改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法，其步驟為:
[0009](I)對細(xì)胞進(jìn)行超聲空化
[0010]a.用胰酶消化處理細(xì)胞，然后1300-500r/min離心5_10分鐘，棄去上清；
[0011 ] b.加入DMEM培養(yǎng)基和超聲造影劑微泡，充分混勻，放在密封試管中；
[0012]c.采用共軸聚焦超聲發(fā)射裝置，聚焦超聲換能器安放在該裝置底部，裝有細(xì)胞混合液的密封試管裝在該裝置頂部固定器上，保證聚焦超聲換能器與密封試管共軸，同時，聚焦超聲換能器和密封試管之間距離可做連續(xù)調(diào)節(jié)，保證密封試管中液體處于聚焦超聲換能器焦點(diǎn)位置，從而使作用在細(xì)胞混合液中的超聲能量達(dá)到最大，聚焦超聲換能器工作在MHz頻段，占空比在0.5% -100%之間可調(diào)；
[0013](2)電鏡下觀察超聲對細(xì)胞株的表面微結(jié)構(gòu)的改變情況。
[0014]優(yōu)選地，所述的步驟⑴中，選擇的超聲強(qiáng)度分別為:0.05,0.2,0.5、1.0MPa，作用于細(xì)胞株各20秒。
[0015]優(yōu)選地，所述的步驟(I)中，選擇超聲強(qiáng)度分別為:0.2,0.5MPa。
[0016]優(yōu)選地，所述的步驟(I)中，所述的超聲空化條件如下:1.0MH的超聲對細(xì)胞株作用20秒。
[0017]3、有益效果
[0018]采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，與已有的公知技術(shù)相比，具有如下顯著效果:
[0019](I)本發(fā)明提供的一種聚焦超聲改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法，通過超聲的聲空化效應(yīng)改變了細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)打開；通過調(diào)整換能器焦點(diǎn)位置可以精確控制超聲作用區(qū)域；通過控制超聲的強(qiáng)度來控制細(xì)胞打開孔徑的大小，不會因?yàn)槌晱?qiáng)度過大而導(dǎo)致細(xì)胞收到損傷；
[0020](2)現(xiàn)有技術(shù)中，慣常采用電穿孔技術(shù)來改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是該方法是通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，將細(xì)胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差會導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時間會不可逆的傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞，而聚焦超聲和電穿空相比優(yōu)點(diǎn)在于可以準(zhǔn)確的定位，且不影響周邊組織細(xì)胞；
[0021](3)采用本發(fā)明的技術(shù)方案控制超聲的強(qiáng)度，我們選用的強(qiáng)度為0.05，0.2，0.5，
1.0MPa，作用時間是20秒。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲在低聲壓下時，其超聲空化效應(yīng)對細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)打開不充分，但是隨著超聲強(qiáng)度的增加超聲空化效應(yīng)越強(qiáng)，但是強(qiáng)度太高反而會損傷細(xì)胞。為此，通過實(shí)驗(yàn)我們選擇超聲的頻率為0.2-0.5MPa強(qiáng)度，選擇適宜的參數(shù)，可以控制超聲空化效應(yīng)對超微結(jié)構(gòu)改變的大小；
[0022](4)低強(qiáng)度的超聲是一種機(jī)械刺激，不使用有機(jī)溶劑，可以減輕對細(xì)胞的損傷作用。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明采用的超聲模式圖；
[0024]圖2是細(xì)胞膜上聲孔效應(yīng)的掃描電鏡圖像；
[0025]圖3是超聲作用下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化示意圖，其中，(a)是無超聲作用細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖；(b) IMH超聲福照下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖；
[0026]圖4是超聲聯(lián)合川芎嗪對細(xì)胞凋亡的影響示意圖；
[0027]圖5是超聲聯(lián)合川芎嗪對凋亡相關(guān)基因的改變示意圖；
[0028]圖6是超聲聯(lián)合川考嘆對炎癥相關(guān)因子的變化不意圖；
[0029]圖7是超聲聯(lián)合川芎嗪對氧化應(yīng)激糖酵解酶LDH含量影響的變化示意圖；
[0030]圖8是超聲聯(lián)合川芎嗪對氧化應(yīng)激超氧化物歧化酶(SOD)含量影響的變化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為進(jìn)一步了解本發(fā)明的內(nèi)容，結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。
[0032]實(shí)施例1
[0033]結(jié)合圖1，本實(shí)施例的一種利用聚焦超聲改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的方法，具體步驟如下:
[0034]步驟一、腦缺血再灌注細(xì)胞損傷模型的建立:
[0035]a.確定建立細(xì)胞損傷模型的谷氨酸濃度和作用時間。其具體確定過程如下:取PC12細(xì)胞株，用神經(jīng)生長因子處理，生長分化出突觸；然后用含不同濃度谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞，選用的谷氨酸濃度為50，25，12.5,6.25umol/L，選用的時間點(diǎn)分別是12，24，48小時，然后用流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡率，根據(jù)細(xì)胞凋亡的情況選取建立谷氨酸模型的最佳濃度和處理時間。在實(shí)驗(yàn)的過程中我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)谷氨酸濃度大于12.5umol/l時細(xì)胞大量死亡；當(dāng)谷氨酸濃度小于12.5umol/l時，谷氨酸對細(xì)胞損傷的較輕不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研宄發(fā)現(xiàn)谷氨酸作用時間過長大于12小時，時也會導(dǎo)致細(xì)胞的大量死亡，這樣不利于我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞凋亡的結(jié)果，最終選擇谷氨酸濃度為12.5umol/l，作用時間為12小時作為建立谷氨酸損傷模型的最終濃度和時間。
[0036]b.取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞用胰酶消化處理，然后1500r/min離心5分鐘，棄去上清。PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37°C 5% CO2培養(yǎng)24h后，換成含谷氨酸12.5umol/l的DMEM培養(yǎng)基對PC12細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理12小時；然后換成正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；造成谷氨酸損傷模型。通過建立此模型來驗(yàn)證超聲對PC12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
[0037]步驟二、川芎嗪保護(hù)模型:
[0038]將川芎嗪原液用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度。PC1