擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因與甲酸脫氫酶基因的雙表達應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶5?階基因與甲酸脫氫酶/??因的植物表達載體在制備吸收甲醛能力增強的雙表達轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲醛(HCHO)被廣泛的用于化工合成、工業(yè)制造、醫(yī)藥合成等所涉及的化學(xué)領(lǐng)域及其他工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在化學(xué)農(nóng)藥及其中間體合成領(lǐng)域甲醛有著舉足輕重的作用?，F(xiàn)代化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)過程中不能避免的要產(chǎn)生大量含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水，這些農(nóng)藥生產(chǎn)廢水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲縮醛等物質(zhì)，由于廢水中甲醛的存在使得其處理變得十分困難。而且按照國家標(biāo)準《污水綜合排放標(biāo)準(GB8978-1996)》規(guī)定:二級排放標(biāo)準的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水要直接排放不僅不符合環(huán)保要求，并且對動植物都具有嚴重的危害性。由于甲醛在工業(yè)生產(chǎn)中的用途很廣，完全的限制是不現(xiàn)實的，所以必須對工業(yè)生產(chǎn)中甲醛廢水進行無害化處理。另一方面隨著生活質(zhì)量的不斷提高裝修已成為現(xiàn)代生活的一部分，而裝修所用的材料膠合板、細木工板、中密度纖維板和刨花板等含有大量HCH0，這是因為目前生產(chǎn)人造板材使用的多種膠粘劑比如脲醛樹脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛樹酯、酚醛樹脂等多以HCHO為主要成分，所以HCHO氣體成為裝修房間中空氣污染的主要化學(xué)物質(zhì)之一。
[0003]HCHO是一種廣泛存在的有毒化學(xué)物質(zhì)，它可以溶于水中以液態(tài)存在，也可以揮發(fā)成為氣體以氣態(tài)形式存在。HCHO可以被還原為甲醇也可以被氧化為甲酸，而這三種物質(zhì)對生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基團因此具有較強的親電特征，其具有十分活潑的化學(xué)性質(zhì)能與各種脂類、核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性反應(yīng)，并能導(dǎo)致生物體內(nèi)各種相關(guān)物質(zhì)失去生物活性。HCHO對人和動物具有較強毒性，它能導(dǎo)致皮膚敏感并能引起皮膚炎癥；HCH0也能進入呼吸系統(tǒng)并引起該系統(tǒng)出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，通過血液循環(huán)被運輸?shù)饺硪鸱尾坎∽?、肝臟器官損傷、免疫調(diào)節(jié)能力下降等。如果我們長期使用含有HCHO的水，會引發(fā)胃部不適、免疫障礙、貧血以及引起神經(jīng)性病變，會對生物體產(chǎn)生急性或慢性的危害。如果人們暫時留在含有低劑量HCHO氣體的室內(nèi)時會使人產(chǎn)生不舒服的感覺，而長時間呼吸微量的HCHO會導(dǎo)致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、結(jié)腸癌、腦癌、月經(jīng)紊亂、妊娠綜合癥、新生兒染色體異常、細胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連、白血病、青少年記憶力和智力下降等。當(dāng)房間內(nèi)HCHO氣體濃度升高時，可刺激人眼使人流眼淚并引起咽喉不適或疼痛。而人體接觸更高濃度HCHO氣體可引起咳嗽、惡心或肺水腫等不良反應(yīng)，如果HCHO氣體濃度達到30mg/m3時可致人死亡。相對于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TD1、VOC等有害物質(zhì)來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。
[0004]甲酸脫氫酶(FDH)和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)是植物一碳代謝的兩個關(guān)鍵酶，F(xiàn)DH可將甲酸氧化為C02，SHMT介導(dǎo)Gly和Ser之間的相互轉(zhuǎn)換。FDH和SHMT的表達可被多種非生物脅迫誘導(dǎo)，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。在擬南芥甲醛代謝過程中FDH能將甲醛代謝產(chǎn)生的甲酸氧化為C02，SHMT則催化Gly和5，1-13CH2-THF (四氫葉酸)的反應(yīng)產(chǎn)生絲氨酸。FD_ 的表達都受甲醛脅迫的誘導(dǎo)。絲氨酸(Ser)是擬南芥甲醛代謝的重要產(chǎn)物之一，但在煙草甲醛代謝過程沒有產(chǎn)生Ser。本研宄嘗試利用PrbcS啟動子在WT煙草葉片中過量表達擬南芥光呼吸途徑的SHMTl產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草，將煙草甲醛的碳代謝流引入Ser的合成，增強煙草對甲醛的抗性和吸收能力。
[0005]利用PrbcS啟動子在轉(zhuǎn)基因葉片中過量表達擬南芥甲酸代謝途徑的FDH產(chǎn)生SHMT/FDBm基因煙草，用13C-NMR分析轉(zhuǎn)基因煙草對2mM和6mM液體甲醛的代謝機制，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中5?? /??的同時過量表達不能將甲醛的碳代謝流引入Ser的合成，但卻能將甲醛的碳代謝流引入葡萄糖([U-13C]G1uc)的合成，在煙草中引入了一條新的甲醛代謝途徑。雙轉(zhuǎn)基因煙草葉片甲醛代謝產(chǎn)生[4-13C]Asn、[3-13C]Gln、[U-13C] OA和H13COOH的量大于/??? 5M/7單轉(zhuǎn)基因煙草，說明甲醛脅迫下FD_ 5?階在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的同時過量表達使煙草原有甲醛代謝途徑的作用大大增強，這使得
轉(zhuǎn)基因煙草對液體甲醛的抗性和吸收能力比F_ 5M/7單轉(zhuǎn)基因煙草的強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于將擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶堪因的植物表達載體與甲酸脫氫酶/??因的植物表達載體在制備吸收甲醛能力增強的雙表達轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因的GenBank登錄號為6899944，甲酸脫氫酶/??基因的GenBank登錄號為6625952，制備含有擬南芥絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因(即5?階基因)和甲酸脫氫酶基因(即/??基因)的耐受甲醛的雙表達轉(zhuǎn)基因植物。
[0007]本發(fā)明所述的絲氨酸輕甲基轉(zhuǎn)移酶基因SHM他cDNA來源于擬南芥(Arabidopsisthaliana), GenBank登錄號為6899944，甲酸脫氫酶基因FD_ cDNA來源于擬南芥
{Arabidopsis thaliana), GenBank 登錄號為 6625952。
[0008]本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的:
1、植物表達載體的構(gòu)建
1.1 基因植物表達載體的構(gòu)建
(1)從GenBank中查找擬南芥5?階基因的cDNA序列，并設(shè)計序列如下的一對引物:
上游引物 5’ GCATGCATGGCGATGGCCATGGCTCTTC 3’ (含有 5^1 位點)；
下游引物 5’ CTCGAGTTAGTTCTTGTACTTCATG 3’ (含有通ol 位點)；
上游引物5’端形成Sphl酶切位點；下游引物3’末端加ZAoI酶切位點，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴增，通過PCR擴增得到5?階基因的全長cDNA (1554bp)；
(2)回收并純化5?階全長基因cDNA片段，并將其連接到pMD-19T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD19-5M^;
(3)構(gòu)建入門載體pENTR-PrbcS-5Mi7；用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD19_5M^pENTR-PrbcS-^m回收5?於的cDNA片段和載體DNA片段pENTR，進行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，得到入門載體pENTR-PrbcS-5M^;
(4)構(gòu)建植物表達載體pK2-PrbcS-5Mi7；通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把克隆到植物表達載體PK2GW7中，獲得SHMm因的植物表達載體PK 2-?rbc^~SHMT0
[0009]1.2 /??基因植物表達載體的構(gòu)建
(1)從GenBank中查找擬南芥/??基因的cDNA序列，并設(shè)計序列如下的一對引物:
上游引物 5，GCATGCATGGCGATGAGACAAGCCGCTAAGG 3，(含有 5^1 位點)；
下游引物 5’ CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA 3’ (含有通ol 位點)
上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位點；下游引物3’末端加Xhol酶切位點，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴增，通過PCR擴增得到/??基因的全長cDNA(1155bp)；
(2)回收并純化/??全長基因cDNA片段，并將其連接到PMD-19T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD19-/?7;
(3)構(gòu)建入門載體pENTR-PrbcS-T*-/?^ 用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD19-/^_PpENTR-PrbcS-T*-GFP，回收FDI^ cDNA片段和載體DNA片段pENTR，進行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，得到入門載體pENTR-PrbcS-T*-/?^;
(4)構(gòu)建植物表達載體pH2-PrbcS-T*-/?%通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把/??亞克隆到植物表達載體PH2GW7中，獲得FD龜因的植物表達載體pH 2-PrbcS-T*-/m
[0010]本發(fā)明的植物表達載體對那些能實施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、矮牽牛、非洲菊等。在本發(fā)明的實施中以煙草為例說明該表達載體的應(yīng)用過程。
[0011]2、煙草的轉(zhuǎn)化
采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK2-PrbcS-5MT進入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，涂布在Spe平板上生長兩天后，用菌落PCR檢測質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。PCR擴增用5Ζ?的上下游引物，擴增片段理論長度為1.6kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。制備煙草、Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，篩選具有卡那霉素(Km)抗性植株，將其轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基(含有3%蔗糖)上繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得無菌的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0012]以已經(jīng)成功篩選出的過量表達擬南芥5?階煙草作為受體，將pH 2-PrbcS-T*-/W植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens C58C1，pMP90)中。使用植物葉盤法由農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pH2-PrbcS-T*-/^%植物表達載體轉(zhuǎn)化進入已經(jīng)檢測正確的過量表達擬南芥5?階煙草中。轉(zhuǎn)化完成后的葉盤置于25°C恒定光照(ΙΟΟμπιοΙ.πΓ2.s—1)下進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因小苗需在含有卡那霉素(Km，50 μ g/ml)和潮霉素(Hyg，20 μ g/ml)的雙抗性培養(yǎng)基上進行篩選，所得的再生苗中就有過量表達擬南芥SHMT/FDH煙草。
[0013]3、SHMT/FD龜因插入情況的檢測
為了檢測目的基因是否插入有卡那霉素和潮霉素抗性植株煙草的基因組，以抗性苗的基因組為模板，利用上下游弓I物做PCR檢測，PCR擴增產(chǎn)物片段理論長度分別為1.6kb和1.2kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因SHMT/已插入到煙草基因組中。
[0014]4、SHMT/m龜因轉(zhuǎn)錄水平的檢測
為了檢測目的基因在雙表達轉(zhuǎn)基因煙草中是否轉(zhuǎn)錄，提取抗性苗RNA，利用SHMm 上下游引物進行RT-PCR檢測，RT-PCR擴增片段理論長度分別為1.6kb和1.2kb，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因SHMT/FDH烈?職因煙草中正常轉(zhuǎn)錄。
[0015]5、SHMT/FDm因表達水平的檢測
為了檢測目的基因/??編碼的蛋白在雙表達轉(zhuǎn)基因煙草中是否表達，選取經(jīng)RT-PCR檢測正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，提取總蛋白進行Weste