裝有化發(fā)酵培養(yǎng)基的化 發(fā)酵罐中于37°C、250r/min、氮氣通量0. 2vvm、用5M化0H維持抑為7. 0條件下進行發(fā)酵培 養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔1或2小時取發(fā)酵液，測定甘油濃度和菌體0D，并將發(fā)酵液于1000化/ min離屯、10分鐘，取上清進行高效液相色譜分析。
[0071] 發(fā)酵結果如圖3所示，菌種W3發(fā)酵5. 3小時便將40g/L的甘油消耗完，PD0濃度達 至IJ17. 84g/l，生產(chǎn)強度為3. 37g/(L.h)，摩爾轉化率為0. 65mol/mol;副產(chǎn)物2, 3-了二醇為 0. 3g/l，己醇為0. 77g/l，己酸為4. 04g/l，甲酸為2g/l，乳酸為0. 66g/l，巧樣酸為0. 56g/L。 菌種W3和混菌NHN8的產(chǎn)物及產(chǎn)量有所差異，但1，3-丙二醇生產(chǎn)效率較高，可見它在混菌 NHN8中起到主導作用。
[0072] 實施例4單菌Y1的批次發(fā)酵
[0073] 按照實施例2所述的方法，將實施例1中獲得的單菌Y1接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 小時，獲得種子培養(yǎng)液，然后把種子培養(yǎng)液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培 養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔1小時取發(fā)酵液，測甘油濃度及菌體0D，并將發(fā)酵液離屯、取上清進行 高效液相色譜分析。
[0074] 發(fā)酵結果如圖4所示，菌種Y1表現(xiàn)出不同于W3的發(fā)酵特征，Y1生長緩慢，發(fā)酵23 小時才將甘油消耗完，且其主產(chǎn)物為己醇（濃度為12. 69g/L)，1，3-丙二醇濃度僅為2. 05g/ L乳酸 2. 93g/l，不產(chǎn) 2, 3- 了二醇。
[0075] 實施例5單菌Y5的批次發(fā)酵
[0076]按照實施例2所述的方法，將實施例1中獲得的單菌Y5接入種子培養(yǎng)基于37°C、 20化/min搖床中進行種子培養(yǎng)12小時，獲得種子培養(yǎng)液，然后把種子培養(yǎng)液按照10%體積 比接種到裝有化發(fā)酵培養(yǎng)基的化發(fā)酵罐中于37 °C、250r/min、氮氣通量0. 2vvm、維持抑為 7. 0條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔1或2小時取發(fā)酵液，測甘油濃度及菌體0D， 并將發(fā)酵液于1000化/min離屯、10分鐘，取上清進行高效液相色譜分析。
[0077]發(fā)酵結果如圖5所示，菌種Y5表現(xiàn)出介于W3和Y1之間的發(fā)酵特征，發(fā)酵9. 5小 時將甘油消耗完，生長速度比W3慢，比Y1快。主要產(chǎn)物是1，3-丙二醇化63g/L)和己醇 (7. 6g/L)，不產(chǎn)2, 3- 了二醇，有機酸中甲酸1. 48g/L。1，3丙二醇的產(chǎn)量比W3低，比Y1高， 摩爾轉化率為0. 32mol/mol。
[007引實施例6不同起始甘油濃度下混菌NHN8的批次發(fā)酵
[0079] 按照實施例2所述的方法，將實施例1中獲得的混菌NHN8接入種子培養(yǎng)基中 于37°C、200r/min搖床中進行種子培養(yǎng)12小時，獲得種子培養(yǎng)液；然后把種子培養(yǎng)液按 照10%體積比分別接種到含有不同起始甘油濃度、裝有化發(fā)酵培養(yǎng)基的化發(fā)酵罐中，于 37°C、250r/min、氮氣通量0. 2vvm、抑7. 0條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔1-2小 時取發(fā)酵液，測定甘油濃度和菌體OD，并將發(fā)酵液離屯、取上清進行高效液相色譜分析。
[0080] 發(fā)酵過程中的甘油消耗曲線如圖6所示，菌種NHN8有很強的底物耐受性，可W在 高達200g/L的甘油濃度下生長，優(yōu)選底物濃度為120g/L。當?shù)孜锲鹗紳舛鹊陀?20g/L時， 甘油消耗較快，發(fā)酵用時較少；當?shù)孜餄舛雀哂?20g/L時，發(fā)酵時間延長。發(fā)酵液中1,3-丙 二醇濃度最高可達81. 4g/l，且均不產(chǎn)2, 3- 了二醇。
[0081] 實施例7不同起始甘油濃度下單菌W3的批次發(fā)酵
[0082] 按照實施例6所述的方法，將實施例1中獲得的單菌W3接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)12 小時，獲得種子培養(yǎng)液，然后把種子培養(yǎng)液按照10%體積比分別接種到含有不同起始甘油 濃度、裝有化發(fā)酵培養(yǎng)基的化發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每隔1~2小時取發(fā) 酵液，測定甘油濃度和菌體OD，并將發(fā)酵液離屯、取上清進行高效液相色譜分析。
[0083] 發(fā)酵過程中的甘油消耗曲線如圖7所示，單菌W3的底物耐受性比混菌NHN8差，可 W在低于lOOg/L甘油濃度下生長。甘油濃度為60-100g/L時，發(fā)酵時間均比混菌NHN8的 延長，且lOOg/L情況下甘油沒有消耗完，在4化還有23. 05g/L甘油，1，3-丙二醇濃度僅為 36. 25g/l，摩爾轉化率為0. 42mol/mol，生產(chǎn)強度為0. 77g/(L.h)。
[0084] 實施例8甘油濃度120g/L時混菌NHN8的批次發(fā)酵
[0085] 按照實施例2所述的方法，將實施例1中獲得的混菌NHN8接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12小時，獲得種子培養(yǎng)液，然后把種子培養(yǎng)液W10%接種量加入起始甘油濃度為120g/L的 發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
[0086] 發(fā)酵結果如圖8所示，菌種NHN8發(fā)酵18. 75小時便將甘油消耗完，1，3-丙二醇濃 度達到59. 74g/l，生產(chǎn)強度為3. 19g/(L.h)，摩爾轉化率為0. 65mol/mol;副產(chǎn)物主要為己 酸（10. 83g/L)、己醇巧.OOg/L)、乳酸化04g/L)和班巧酸（3. 05g/L)。混菌饑的8具有較強 的底物耐受性，1，3-丙二醇的轉化率高，生產(chǎn)強度大，且產(chǎn)物中沒有2, 3- 了二醇。
[0087] 實施例9不同比例混合的混菌批次發(fā)酵
[008引按照實施例2所述的方法，將實施例1中獲得的W3、Y1和Y5分別接入種子培養(yǎng)基 中培養(yǎng)12小時，獲得種子培養(yǎng)液，然后將它們W如表1所述的不同菌體數(shù)的比例混合，接入 發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，兩株菌混合發(fā)酵的初始甘油濃度為lOOg/L，=株菌混合發(fā)酵的初始甘 油濃度為120g/l，發(fā)酵結果如表1所示。
[0089] 表1不同比例混合的混菌發(fā)酵結果
[0090]
【主權項】
1. 一種利用混菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于，將保藏號為CGMCC NO. 10440 的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae)W3、保藏號為CGMCCNO. 10439 的肺 炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae)Yl和保藏號為CGMCCNO. 10438的肺炎克雷伯氏 菌（Klebsiellapneumoniae)Y5,在以甘油為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中混合發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二 醇。
2. 根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌 W3、Y1和Y5的接種量比例為150~250:10~20:50~100,優(yōu)選接種量比例為208:17:82。
3. 根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于，混合發(fā)酵的甘油起始 濃度為20~200g/L，優(yōu)選濃度為120g/L。
4. 根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于，混合發(fā)酵的發(fā)酵液中 不含2, 3-丁二醇。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用混菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，該方法將保藏號分別為CGMCC NO.10440、10439和10438的肺炎克雷伯氏菌W3、Y1和Y5，在以甘油為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中混合發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇。本發(fā)明的混菌具有良好的底物耐受性，且發(fā)酵產(chǎn)物中副產(chǎn)物較少，尤其是不含2,3-丁二醇，有利于主產(chǎn)物1,3-丙二醇的分離。本發(fā)明方法克服了單一菌株底物耐受性差的缺點，提高了生產(chǎn)效率，產(chǎn)物不含2,3-丁二醇，避免了后期分離中的難題，混菌可耐受甘油濃度達到200g/L，1,3-丙二醇產(chǎn)量達到81.40g/L。該方法有望為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的工業(yè)化提供簡單經(jīng)濟的發(fā)酵工藝。CGMCC NO. 1043920150126CGMCC NO. 1044020150126CGMCC NO. 1043820150126
【IPC分類】C12R1-22, C12P7-18
【公開號】CN104774879
【申請?zhí)枴緾N201510212125
【發(fā)明人】修志龍, 劉會芳, 陳洋, 姜莉莉, 孫亞琴
【申請人】大連理工大學
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月29日