一種生物催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種新型生物催化法"一鍋法"合成ka-氨基了酸及純化濃縮結(jié)晶 得到高純度ka-氨基了酸的方法，屬于生物合成領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] ka-氨基了酸是抑制人體神經(jīng)信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強(qiáng)葡萄糖磯酸 醋酶的活性，促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的作用山-a-氨基了酸也是重要的醫(yī)藥中間體原料，已經(jīng)廣 泛應(yīng)用于藥物的合成，如抗結(jié)核藥物鹽酸己胺了醇，抗癒痛藥物左己拉西坦等藥物的合成。
[0003]目前，國內(nèi)外ka-氨基了酸的生產(chǎn)方法分為化學(xué)法和生物法，化學(xué)法是比較經(jīng) 典的方法，主要有化學(xué)合成和化學(xué)拆分?；瘜W(xué)合成主要是W正了酸和漠為起始原料，經(jīng)a 面代反應(yīng)制得a-漠了酸，在氨水中合成a-氨基了酸，化學(xué)拆分法是用手性拆分試劑和消 旋的a-氨基了酸形成非對應(yīng)異構(gòu)體進(jìn)行拆分得到ka-氨基了酸，光學(xué)純度可達(dá)98 %，但 是此方法需要昂貴的手性拆分試劑，成本較高，工業(yè)生產(chǎn)不易采用，而且產(chǎn)生大量的有機(jī)費(fèi) 溶劑污染環(huán)境；
[0004] 生物法又包括微生物發(fā)酵法和細(xì)胞外酶轉(zhuǎn)化法，微生物發(fā)酵法專屬性較強(qiáng)，條件 溫和，環(huán)境污染少，但存在反應(yīng)產(chǎn)物成分復(fù)雜，分離繁瑣的缺點(diǎn)；酶催化轉(zhuǎn)化則是一種高選 擇性反應(yīng)，不同種類的酶可作用于不同構(gòu)型和不同種類的特定底物，從而達(dá)到定向轉(zhuǎn)化的 目的。目前酶法制備心〇-氨基了酸主要有S種，一種是對消旋a-氨基了酸進(jìn)行酶法拆 分制備，主要是用醋酢己酷化氨基了酸，再用氨基酷化酶進(jìn)行拆分，產(chǎn)物收率約35%，同時 通過將剩余的酷化a-氨基了酸通過化學(xué)法消旋來利避免了使用劇毒原料，降低了生產(chǎn)成 本，但仍然存在反應(yīng)步驟多，總收率不高等問題。另一種是Wa-幾基了酸為原料，通過脫 氨酶或者轉(zhuǎn)氨酶來催化制備。但是反應(yīng)底物濃度低，生產(chǎn)成本較高。還有一種方法是用蘇 氨酸脫氨酶將底物蘇氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物a-幾基了酸，然后再用亮氨酸脫氨酶將其轉(zhuǎn)化 為最終產(chǎn)物ka-氨基了酸。但是需要甲酸脫氨酶或葡萄糖脫氨酶偶聯(lián)，建立輔酶再生系 統(tǒng)，才能使反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，仍然存在生產(chǎn)成本高，工業(yè)復(fù)雜，生產(chǎn)難度大等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)中ka-氨基了酸的合成方法存在過程繁瑣、反應(yīng)條件苛刻、收 率低、分離提純困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等一系列缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種W廉價 的己醇和甘氨酸為原料，W四種酶復(fù)合物為催化劑"一鍋法"合成高純度ka-氨基了酸 的方法，申請人創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)，采用特定比例和種類的酶，能夠制備得到純度和產(chǎn)率高的 ka-氨基了酸，該方法W水相為反應(yīng)體系，環(huán)保、廉價，設(shè)備要求低、酶可W反復(fù)使用，成本 低，易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種高光學(xué)純k a-氨基了酸的生物合成方法，該方法是在反應(yīng)液 中，己醇和甘氨酸原料在醇脫氨酶、蘇氨酸醒縮酶、蘇氨酸脫氨酶和k氨基酸脫氨酶復(fù)合 物的催化作用下，于抑為6.0~8.0,溫度為20~40°C的條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn) 物經(jīng)過層析分離、電滲析脫鹽、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、真空干燥處理，得到高純度a-氨基 了酸晶體；所述的醇脫氨酶、蘇氨酸醒縮酶、蘇氨酸脫氨酶和k氨基酸脫氨酶總活力比為 4.5-25:3-5 ;6-25:4. 5-20。
[0007] 優(yōu)選醇脫氨酶、蘇氨酸醒縮酶、蘇氨酸脫氨酶和k氨基酸脫氨酶的活力比為 2:1:3:2 ；
[000引所述的己醇具有式1結(jié)構(gòu)：
[0009]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 高光學(xué)純L-a-氨基丁酸的生物合成方法，其特征在于，在反應(yīng)液中，乙醇與甘氨 酸原料在醇脫氫酶、蘇氨酸醛縮酶、蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶復(fù)合物的催化作用 下，于pH為6. 0~8. 0,溫度為20~40°C的條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過層析分 離、電滲析脫鹽、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、真空干燥處理，得到高光學(xué)純度L-a-氨基丁酸晶 體； 所述的乙醇化合物具有式1結(jié)構(gòu)：
所述的甘氨酸具有式2結(jié)構(gòu)：
所述的L-a-氨基丁酸具有式3結(jié)構(gòu)：
2. 如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，生物催化劑為醇脫氫酶、蘇氨酸醛縮酶、蘇氨 酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶的復(fù)合物，復(fù)合物可以是混合液態(tài)酶或固定化酶，也可以是工程 菌。其中L-氨基酸脫氫酶可以選自L-亮氨酸脫氫酶、L-丙氨酸脫氫酶、L-纈氨酸脫氫 酶。
3. 如權(quán)利要求1所述方法，酶復(fù)合物中醇脫氫酶、蘇氨酸醛縮酶、蘇氨酸脫氨酶和L-氨 基酸脫氫酶在反應(yīng)液中加入量的活力比為4. 5-25:3-5 :6-25:4. 5-20,優(yōu)選2:1:3:2。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，乙醇化合物在反應(yīng)液中的質(zhì)量百分比濃度 為10 %~30%，乙醇化合物與甘氨酸的摩爾比為1:0. 1~0. 5。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反應(yīng)過程中加入不少于20ppm的NAD 或NADP輔因子，和不少于30ppm的磷酸吡哆醛輔因子。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化體系依賴于蘇氨酸醛縮酶和蘇氨 酸脫氨酶推動反應(yīng)，不另需獨(dú)立的輔酶再生系統(tǒng)。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)產(chǎn)物通過電滲析脫鹽 后，維持溫度在20~40°C范圍內(nèi)，加入活性炭進(jìn)行吸附0. 5~1.Oh;其中，活性炭為木質(zhì)活 性炭，木質(zhì)活性炭的使用量為L-a-氨基丁酸溶液體積的3. 0~5. 0%。。
8. 如權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述的電滲析脫鹽過程中采用的極水 為電導(dǎo)在5. 0~10.Oms/cm之間的硫酸鈉溶液，濃水為去離子水，終止物料電導(dǎo)為8. 0~ 10.Oms/cm〇
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶催化反應(yīng)以反應(yīng)液中甘氨酸摩爾 轉(zhuǎn)化率大于99 %為反應(yīng)終點(diǎn)。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的層析分離是通過離子交換樹脂或吸 附樹脂進(jìn)行分離。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法同樣適用于其它醇類與甘氨酸 進(jìn)行其它L-a-氨基酸的合成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種合成具有高光學(xué)活性的L-α-氨基丁酸的新方法，綜合運(yùn)用了醇脫氫酶、蘇氨酸醛縮酶、蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶，將乙醇和甘氨酸原料“一鍋法”直接合成為L-α-氨基丁酸。本發(fā)明基于利用簡單易得的原料一鍋合成L-α-氨基丁酸，具有操作步驟少、環(huán)境友好、生物安全性好、設(shè)備簡單的優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)光學(xué)活性高的L-α-氨基丁酸及L-α-氨基酸一系列產(chǎn)品。
【IPC分類】C12P13-04
【公開號】CN104774881
【申請?zhí)枴緾N201510168601
【發(fā)明人】許崗, 曾紅宇, 趙士敏, 陳梅
【申請人】湖南福來格生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月10日