Brca2的3′非翻譯區(qū)在制備腫瘤診斷、治療和預后試劑中的應用
【技術領域】
[000。 本發(fā)明設及BRCA2的3'UTR的新應用，特別設及BRCA2的3'UTR在制備腫瘤診斷、 治療和預后試劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機構（InternationalAgencyforResearchon Cancer，lARC)發(fā)布的全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GLOBOCAN)表明；2012年全球新增約 1，410萬例癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)達820萬(相當于全年總死亡人數(shù)的14. 6%)。男性最常 見的癌癥包括肺癌、前列腺癌、大腸直腸癌、W及胃癌；女性最常見的則是乳腺癌、大腸直腸 癌、子宮頸癌和肺癌。由于DNA的損傷會隨著年齡而累積增加，人們生活方式的改變，W及 全球人口增長和老齡化，全球的罹癌率整體而言持續(xù)走高，預計至2025年癌癥新增發(fā)病將 高達1930萬例。癌癥的篩查、早期診斷及治療尤為迫切，而腫瘤相關的發(fā)病機制尚未完全 清楚，通過對癌癥相關基因改變的研究，尋找與癌癥發(fā)生相關的不穩(wěn)定基因，探究癌癥干細 胞與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關機制。癌癥干細胞是指具有干細胞性質的癌細胞，即具有無限自 我更新潛能W及多細胞分化的能力，是造成癌癥轉移、復發(fā)，是腫瘤產生耐藥性W及對放化 療法產生抗性的重要原因。針對癌癥干細胞標志物的研究可幫助探究更有效的癌癥早期診 斷和治療手段，是當前癌癥基因領域的一個重要研究方向，同時能夠為腫瘤藥物的研制提 供新的祀點。
[0003]BRCA2 基因（Breastcancer2,earlyonset,GenBank登錄號；NM_000059. 3); 編碼蛋白為腫瘤抑制因子BRCA2,該種蛋白主要設及基因組穩(wěn)定性的維持，特別是對雙鏈 DNA修復的同源重組通路的調節(jié)。BRCA2在多種腫瘤中，轉錄水平得到上調，蛋白表達卻被 抑制，提示可能是BRCA2-3'UTR，抑制了翻譯，且BRCA2的RNA過度表達提示了癌癥的預后 不佳，但目前其在腫瘤生長中的相關機制尚不明確。關于轉錄因子BRCA2設及癌癥發(fā)生發(fā) 展的報道日益增多，而BRCA2-3'UTR與癌癥相關的研究還是相對較少的，BRCA2-3'UTR所 促進癌癥生長發(fā)展的機制仍需進一步地闡明。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤檢測試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種腫瘤預后試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種腫瘤治療藥劑。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術方案是： BRCA2的3'端非翻譯區(qū)作為腫瘤檢測、治療、預后祀點的應用。
[0008] -種腫瘤檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測BRCA2的3'端非翻譯區(qū) BRCA2-3'UTR的試劑。
[0009] 進一步的，上述試劑盒中含有實時巧光定量PCR檢測BRCA2-3'UTR的引物序列。
[0010] 進一步的，上述試劑盒中含有實時巧光定量PCR檢測BRCA2-3' UTR的引物序列 5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（沈Q ID N0;1)和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（沈Q ID NO；2)〇
[0011] 進一步的，上述腫瘤為乳腺浸潤性癌，子宮內膜癌，宮頸鱗狀細胞癌和內膜腺癌， 肺腺癌，肺鱗癌，食管癌，胃腺癌，肝細胞癌，結腸腺癌，甲狀腺癌，腎臟腎透明細胞癌，腎臟 腎乳頭狀細胞癌，膀脫尿路上皮癌，頭頸部鱗狀細胞癌。
[001引進一步的，上述試劑盒中含有能夠定量PCR檢測BRCA2-3'UTR的試劑。
[0013] 進一步的，上述試劑盒中含有實時巧光定量檢測BRCA2-3'UTR的引物序列。
[0014] 進一步的，上述試劑盒中含有實時巧光定量PCR檢測BRCA2-3' UTR的引物序列 5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（沈Q ID N0;1)和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（沈Q ID NO；2)〇
[0015] 一種腫瘤治療藥劑，該藥劑中含有能夠特異性沉默BRCA2-3'UTR的試劑。
[0016] 進一步的，上述能夠特異性沉默BRCA2-3'UTR的試劑為鎖核酸序列11^-1;5'-^7TCCAGTC7TA-3'（SEQIDN0;3)，其中斜體加粗所示核巧酸帶有LNA修飾；或者為鎖核酸 序列LNA-2 ;5' - ^TTCC乂iTCTTA-3'（SEQIDNO;4)其中斜體加粗所示核巧酸帶有LNA修 飾。
[0017] 進一步的，上述腫瘤為乳腺浸潤性癌，子宮內膜癌，宮頸鱗狀細胞癌和內膜腺癌， 肺腺癌，肺鱗癌，食管癌，胃腺癌，肝細胞癌，結腸腺癌，甲狀腺癌，腎臟腎透明細胞癌，腎臟 腎乳頭狀細胞癌，膀脫尿路上皮癌，頭頸部鱗狀細胞癌。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)BRCA2-3'UTR能夠增強癌癥干細胞自我更新能力，促進癌癥細胞呈現(xiàn) 癌癥干細胞樣表型，增強癌癥干細胞成球率升高及在體內成瘤的能力，而降低BRCA2-3'UTR 表達或抑制BRCA2-3'UTR發(fā)揮正常功能時，癌癥干細胞成球率下降和體內成瘤能力減弱， 故BRCA2-3'UTR的表達有望成為癌癥治療的潛在祀點，本發(fā)明對于更好地理解癌癥的發(fā)生 機理，制定癌癥風險評估和早期檢測的有效措施具有及其重要意義。
[0019] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)通過實時巧光定量PCR檢測BRCA2的3'端非翻譯區(qū) BRCA2-3'UTR，作為腫瘤檢測和預后的祀點；特異性沉默BRCA2-3'UTR的鎖核酸序列LNA用 作腫瘤治療藥劑。
【附圖說明】
[0020] 圖1為多種腫瘤細胞中BRCA2在轉錄水平的表達情況；TCGA數(shù)據(jù)分析BRCA2在16 種腫瘤中的轉錄表達情況，包括乳腺浸潤性癌炬RCA)，子宮內膜癌扣CEC)，宮頸鱗狀細胞 癌和內膜腺癌（CESC)，前列腺癌（PRAD)，肺腺癌（LUAD)，肺鱗癌（LUSC)，食管癌巧SCA)，胃 腺癌（STAD)，肝細胞癌（LIHC)，膜腺癌（PAAD)，結腸腺癌（C0AD)，甲狀腺癌（THCA)，腎臟腎 透明細胞癌化IRC)，腎臟腎乳頭狀細胞癌化IRP)，膀脫尿路上皮癌炬LCA)，頭頸部鱗狀細 胞癌（HNSC);腫瘤組織（T)與非腫瘤組織（N)中BRCA2的mRNA表達量中位值的比值為T/ N，熱圖中顏色深淺代表的是log2(T/N)值； 圖2為BRCA2mRNA在多種腫瘤細胞中的表達水平，包括乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-231，卵巢癌細胞系SK-0V-3、T0V-21G，肺癌細胞株A549、Calu3,肝癌細胞系 Bel-7402、HepG2,胃癌細胞系MKN28、MGC803,食管癌細胞系Ecal09、Eca9706 ;誤差線表示 =次獨立實驗產生的標準差（SD); 圖3為癌癥組織中BRCA2基因表達情況與患者總體生存的關系曲線；A為乳腺癌，BRCA2低表達（n=563)與BRCA2高表達（n=552) ;B為卵巢癌，BRCA2低表達（n=1166)與 BRCA2高表達（n=415);C為肺癌，BRCA2低表達（n=971)與BRCA2高表達（n=955);D為胃癌， BRCA2低表達（n=381)與BRCA2高表達（n=212)，Log-rank檢驗進行BRCA2低表達(紅線)與 BRCA2高表達(黑線）兩組患者的生存曲線比較具有顯著性差異(乳腺癌，片0. 009 ;卵巢癌， 片0. 028 ;肺癌，K0. 001 ;胃癌，片0. 042); 圖4 A. TargetScan預測BRCA2-3'UTR的microRNA祀位點，位于BRCA2堿基位置10539-10545 ;B.為miR-145與BRCA2-3'UTR的結合作用，RIP實驗分析，沉淀下來的 microRNA由巧光定量PCR分析，U6作為內參； 圖5為BRCA2-3'UTR促進癌細胞的干細胞特性，A.利用antagomiR-145抑制MDA-MB-231細胞中miR-145的表達，實時巧光定量PCR分析BRCA2-3'UTR的表達水平， GAPDH用作管家基因化癌癥干細胞成球實驗分析，抑制miR-145的實驗組細胞的成球率 明顯高于對照組細胞；C.利用LNA結合MDA-MB-231細胞中的BRCA2-3'UTR，實時巧光定量 PCR分析BRCA2-3'UTR的表達水平，GAPDH用作管家基因；D.癌癥干細胞成球實驗分析，LNA 組細胞的成球率明顯低于對照組細胞；誤差線表示=次獨立實驗產生的標準差（SD) ;E為 在BRCA2-3'UTR的miR-145祀位點處設計LNA序列（其中粗斜體及下劃線的堿基為LNA修 飾）； 圖6為BRCA2-3' UTR促進