一種攜帶抗稻瘟病基因Pi65(t)水稻新品種的分子育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種抗稻癌病水稻新品種的分子標(biāo)記輔助 選育方法及其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻癌?。≒yri州lariagriseacav.)是由稻癌病菌（Ma即aportheoiTzae;無性 態(tài)；Pyricularia)引起的水稻病害，其分布范圍十分廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有80余個國家 均有發(fā)生，一般流行年份可造成10% -20 %的減產(chǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時損失可達(dá)40 % -50 %甚至絕 收。20世紀(jì)90年代W來，我國稻癌病的年發(fā)生面積均在380萬hm2W上，每年損失稻谷達(dá) 數(shù)億千克。研究表明，選育抗病水稻品種是防控稻癌病的根本途徑，而利用抗病基因的分子 標(biāo)記輔助選擇抗病個體則是廣為育種家采用的高效技術(shù)手段。但由于稻癌病為小種特異性 病害，病原菌和水稻互作遵循"基因?qū)?模式，如果品種所攜帶的抗病基因?qū)Φ景┎【?的抗譜狹窄，且品種單一化、集中化種植現(xiàn)象普遍，該樣一旦稻癌菌流行小種發(fā)生變化，品 種對稻癌病的抗性便迅速下降。因此，利用廣譜抗性基因選育高抗水稻品種尤為必要。
[0003] 港育129為2009年由迂寧省東港市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中屯、育成的水稻品種，對稻癌病 多年多點(diǎn)表現(xiàn)高抗性化ttp;//www.ricedata.cn/variety/va;ris/603059.htm)，本發(fā)明在 研究過程中將其與迂星1號雜交，利用Fi代花藥培養(yǎng)構(gòu)建了DH群體，利用SLAF-seq技術(shù)， 從港育129中定位到一個廣譜抗病新基因Pi65(t)，并篩選到一個與該基因緊密連鎖的分 子標(biāo)記Inde^l(研究結(jié)果未發(fā)表）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了選育抗稻癌病水稻品種，有針對性的、特異性的選擇含Pi65(t)基因的后代 材料，本發(fā)明提供一種用于檢測水稻抗稻癌病基因Pi65(t)的分子標(biāo)記Indel-1及其在抗 稻癌病分子育種中的應(yīng)用方法，Indel-1與Pi65(t)共分離，可W用于Pi65(t)基因的輔助 選擇，W提高分子標(biāo)記輔助選擇及抗稻癌病品種選育的效率。
[0005] 本發(fā)明提供如下解決方案：
[0006] 一種用于檢測水稻抗稻癌病基因Pi65(t)是否存在的分子標(biāo)記的引物對，如SEQ IDNO;1 和SEQIDNO;2 所示。
[0007] -種檢測水稻親本（作為親本，基因是純合的）中是否存在抗稻癌病基因Pi65(t) 的方法，WSEQIDNO;1和SEQIDNO;2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測基因組DNA，6% 非變性聚丙締酷胺電泳分離，只獲得片段長度為139bp擴(kuò)增子的即為含有抗稻癌病基因 Pi65 (t)。更進(jìn)一步的，擴(kuò)增子包含長度分別為139bp及120bp兩條片段的水稻親本即為不 含有水稻抗稻癌病基因Pi65(t)而含有其感病等位基因。
[000引一種檢測水稻雜交后代中是否存在抗稻癌病基因Pi65(t)的方法，WSEQIDNO; 1和SEQIDNO;2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測基因組DM,6%非變性聚丙締酷胺電泳分 離，只獲得片段長度為139bp擴(kuò)增子的即為含有純合抗稻癌病基因Pi65 (t)。更進(jìn)一步的， 擴(kuò)增子包含長度分別為139bp及120bp兩條片段的水稻雜交后代即為不含有純合抗稻癌病 基因Pi65 (t)而含有其感病等位基因或雜合抗稻癌病基因Pi65 (t)。
[0009] -種攜帶抗稻癌病基因Pi65 (t)水稻新品種的分子育種方法，W港育129為父本， 與其他水稻品種雜交，F(xiàn)i代與該品種回交，獲BC （回交一代），取BCiFi單核靠邊期花藥進(jìn) 行小抱子培養(yǎng)，獲得再生植株，提取各植株基因組DNA，WSEQIDNO;1和SEQIDNO;2為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6%非變性聚丙締酷胺電泳分離，只獲得片段長度為139bp擴(kuò)增子的對 應(yīng)個體即為含有純合抗稻癌病基因Pi65(t)的品系。
[0010] 上述引物對優(yōu)選對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行標(biāo)記鑒定，檢測是否攜帶抗稻癌病 基因Pi65(t)，由于上述引物對是基于基因組序列的插入缺失多態(tài)性設(shè)計(jì)的，因此檢測方 便，準(zhǔn)確率高，該分子標(biāo)記可W作為水稻稻癌病抗病育種中Pi65(t)基因分子標(biāo)記輔助選 擇的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0011] 圖1是分子標(biāo)記Indel-1在抗稻癌病基因Pi65(t)供體品種港育129和8個感病 水稻品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0012] 其中，M;600bp分子量標(biāo)記（TIANGENMD101)，200ng;片段長度分別為；lOObp， 200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。
[001引 1 ;港育129 ;2 ;迂星1號；3 ;迂鹽241 ;4 ;秋光；5 ;鹽豐47 ;6 ;迂鹽2 ;7 ;鐵梗4號； 8 ;迂梗371 ;9 ;迂梗101。
[0014] 其中抗病基因供體品種港育129擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為139bp，而感病等位基因擴(kuò) 增產(chǎn)物片段長度為120bp和139bp。
[0015] 圖2是分子標(biāo)記Indel-1在港育129/迂星1號F2群體中基因型分離的聚丙締酷 胺凝膠電泳圖及表型鑒定結(jié)果。
[0016] 其中，M;600bp分子量標(biāo)記（TIANGENMD101)，200ng;片段長度分別為；lOObp， 200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。
[0017] 圖3是分子標(biāo)記Indel-1在W港育129/迂星1號//迂星1號DH(雙單倍體）群 體中的基因型分離的聚丙締酷胺凝膠電泳圖及表型鑒定結(jié)果。
[0018] 其中，M;600bp分子量標(biāo)記（TIANGENMD101)，200ng;片段長度分別為；lOObp， 200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 ;DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析
[0020] 一、DM提?。–TAB法）；
[0021] 稱取0. 1~0. 2g水稻葉片并剪成1cm長，在液氮中研磨，待液氮蒸發(fā)完后（注意： 勿使樣品融化），迅速轉(zhuǎn)入含65°C預(yù)熱過的提取液（1MTrispH8. 0,lOOmM;5M化C1，1. 0M; 0. 5MEDTA，20mM;10%CTAB，2. 0% )400yL的離屯、管中。輕輕搖勻。
[0022] 60~65°C水浴30~60分鐘，每10分鐘輕輕搖動均勻。
[0023] 加等體積的氯仿/異戊醇（24 : 1)，溫和搖動，使成乳狀液。
[0024]室溫下（溫度不低于15°C)，1200化/min離屯、5min，取上清液。
[00巧]用大孔Tip頭小屯、抽取上清液200yL加入預(yù)冷的2倍體積的無水己醇（或等體 積的異戊醇），-20°C的條件下放置20分鐘W上，500化/min離屯、5分鐘，收集沉淀。
[0026] 70 %己醇洗漆沉淀1~2次。
[0027] 打開管蓋，放潔凈場所驚干，乳白色的DNA沉淀透明即可。
[0028] 100yLTE(Tris-HcllOmM，P服.0;EDTAImM，P服.0)溶解沉淀，并稀釋至 100yg/ mL，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 二、PCR擴(kuò)增；
[0030] PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
[0031] 1.反應(yīng)體系如下；
[0032] 2XI'aqPCRMasterMix(艾德萊PC0902) 10yL，10yM的引物各0.5yL，100yg/ 血的模板DNA1yL，d地2〇 8yL。
[003引3.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸70s， 35個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
[0034] S、PCR產(chǎn)物檢測
[003引取4ULPCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)go1dview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng) 記錄試驗(yàn)結(jié)果。
[0036] 實(shí)施例2 ;供體品種中抗病基因與感病品種中等位基因間的多態(tài)性分析
[0037]W抗稻癌病基因Pi65(t)供體品種港育129和8個感病水稻品種（迂星1號；迂鹽 241 ;秋光；鹽豐47;迂鹽2;鐵梗4號；迂梗371;迂梗101)為試材，種植于溫室。將迂寧地 區(qū)流行的稻癌病菌ZA1、ZA9、ZB1和ZF1分別移植于燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，25~27°C 條件下培養(yǎng)5~7d，待菌絲長滿，用滅菌的棉簽擦掉氣生菌絲后保濕培養(yǎng)，稻癌病菌會大量 產(chǎn)抱。待7個品種稻苗長至5葉1屯、時，將上述擴(kuò)繁培養(yǎng)的各菌株分生抱子分別用120ml 無菌水清洗，用雙層