用于hras突變檢測的引物、探針及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種用于HRAS突變檢測的引物、探針及檢測 試劑盒。
【背景技術】
[0002] RAS蛋白屬于小的GTP酶，當與GTP結合時處于激活狀態(tài)，與GDP結合時處于失活 狀態(tài)。RAS蛋白是信號傳導通路的中樞調(diào)控因子，控制著細胞的增生、分化和生長。RAS基 因是重要的原癌基因，其突變會造成癌癥的發(fā)生。人類基因組中一共鑒別出KRAS、NRAS和 HRASS種RAS基因。KRAS和NRAS的2、3、4外顯子在結直腸癌中易于發(fā)生突變，其突變與西 妥昔單抗和帕巧單抗等EGFR單抗抑制劑藥物的臨床用藥有關。當KRAS和NRAS發(fā)生突變 時，使用西妥昔單抗和帕巧單抗治療浸潤性結直腸癌患者無效（NCCNClinicalPractice GuidelinesinOncologyforColonCancer. 2015)。
[000引HRAS基因是KRAS基因和NRAS基因的同源基因，位于第11號染色體的pl5. 5位 置。HRAS參與了生長因子介導的細胞增生過程。當細胞表面的受體被生長因子激活W后， 激活下游信號轉導通路。HRAS是許多信號轉導通路的上游驅動者，當HRAS與GTP結合時， 處于激活狀態(tài)，開啟下游的信號轉導通路，當HRAS與GDP結合時，處于失活狀態(tài)，關閉下游 的信號轉導通路。膀脫細胞中HRAS的突變可W導致膀脫癌的發(fā)生。當HRAS的第12位密 碼子從甘氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸時，HRAS處于完全的激活狀態(tài)，即使在沒有外界信號傳遞的情 況下，HRAS也會驅動細胞的分裂和增生，從而形成腫瘤。HRAS的突變還預示著膀脫癌的 疾病進展和治療后復發(fā)風險的提高炬haijeeF，NikiforovYE，Endocr化thol.2011S巧； 22(3) : 126-33)。
[0004]在甲狀腺癌中，HRAS的突變頻率為4%，大部分的突變位點為第3號外顯子的第61 號密碼子（COSMIC)。散發(fā)性甲狀腺髓樣癌HRAS的突變比例可達25%(JClin化docrinol Met油.2011May;96巧）：E863-8)。HRAS的突變還預示著甲狀腺癌的遠端轉移。目前，針對 HRAS的藥物篩選也進行到了臨床研究（MouraMMetal.Espinosa,A.V.,J.Gi化ert,J. Fagin. 2014.HRASinThyroidCancer.MyCancerGenome)。
[0005] 雖然HRAS的臨床意義越來越顯現(xiàn)，但是，目前還沒有可此陜速便捷、經(jīng)濟實效的 檢測HRAS的突變的試劑盒。臨床上一般使用sanger測序方法，此方法靈敏度低，只有20%， 耗時長，不適合臨床大規(guī)模應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的；提供一種用于HRAS突變檢測的引物、探針及檢測試劑盒，采用了 特異的MGBBlocker探針，HRAS特異探針和引物，可W檢測腫瘤組織中DNA中HRAS的突變； 利用MGBBlocker阻滯了HRAS非特異性的擴增，提高了其靈敏度，大于ARMS的1% ;可W 在循環(huán)腫瘤DNA中檢測HRAS的突變；操作簡單，檢測廉價，可W大規(guī)模推廣；檢測速度快， 檢測過程大約需要2小時就可完成。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是：
[000引一種用于HRAS突變檢測的引物、探針，包括HRAS外顯子2、3、4的外顯子突變引 物、FAM-MGBhginan探針及Blocker封閉的MGB探針。
[0009] 所述的HRAS外顯子2的12、13外顯子位點點突變引物、FAM-MGB化qman探針及 Blocker封閉的MGB探針具體為；
[0010]
【主權項】
1. 一種用于HRAS突變檢測的引物、探針，其特征在于：包括HRAS外顯子2、3、4的外顯 子突變引物、FAM-MGBTaqman探針及Blocker封閉的MGB探針； 所述的HRAS外顯子2的12、13外顯子位點點突變引物、FAM-MGBTaqman探針及Blocker封閉的MGB探針具體為：
所述的HRAS外顯子3的61編碼子位點點突變引物，F(xiàn)AM-MGB Taqman探針以及Blocker封閉的MGB探針具體為：
所述的HRAS外顯子4的117編碼子位點點突變引物，F(xiàn)AM-MGB Taqman探針以及Blocker封閉的MGB探針具體為：
2. 根據(jù)權利要求1所述的用于HRAS突變檢測的引物、探針，其特征在于： 還包括人類基因組野生型位點引物，F(xiàn)AM-MGBTaqman探針，具體為： RefFCCAAGGCACGAGTAACAAGCTSEQIDNO：49 RefRAATTCCCAAGGACCACCTCACSEQIDNO: 50 Ref-TaqmanFAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGBSEQIDN0:51。
3. -種用于HRAS突變檢測的檢測試劑盒，其特征在于：通過所述的檢測試劑盒提取 DNA樣本，并進行PCR反應，所述的PCR反應體系如下：
4. 根據(jù)權利要求3所述的用于HRAS突變檢測的檢測試劑盒，其特征在于：所述的PCR 反應的條件如下。
5. 根據(jù)權利要求3所述的用于HRAS突變檢測的檢測試劑盒，其特征在于：所述的DNA 樣本包括新鮮腫瘤組織或新鮮病理組織或石蠟包埋組織。
6. 根據(jù)權利要求3所述的用于HRAS突變檢測的檢測試劑盒，其特征在于：所述的DNA 樣本的重量為1克。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于HRAS突變檢測的引物、探針及檢測試劑盒，包括HRAS外顯子2、3、4的外顯子突變引物、FAM-MGB Taqman探針及Blocker封閉的MGB探針。本發(fā)明檢測位點全，檢測HRAS的21種突變類型全面覆蓋HRAS基因突變位點，很好的滿足了臨床的需求；利用MGB Blocker封閉探針，提高了檢測的靈敏度，降低了非專一性結合，使得臨床檢測結果更好判讀。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104774954
【申請?zhí)枴緾N201510198560
【發(fā)明人】張道允, 鞏子英
【申請人】上海允英醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月23日