鑒別驢、馬、狐貍動物源性的引物探針組合物、試劑盒和多重實時熒光定量pcr檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種快速鑒別驢、馬和狐貍3種動物源性成分的引物探針組合物、試 劑盒W及多重實時定量PCR檢測方法，屬于分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002] "天上龍肉，地下驢肉"，是人們對驢肉的最高褒揚。從營養(yǎng)學和食品學的角度看， 驢肉比牛肉、豬肉口感好、營養(yǎng)高。驢肉中氨基酸構成十分全面，8種人體必需氨基酸和10 種非必需氨基酸的含量都十分豐富。驢肉的不飽和脂肪酸含量，尤其是生物價值特高的亞 油酸、亞麻酸的含量都遠遠高于豬肉和牛肉。驢肉一直被人們譽為美味保健的傳統食品， 然而近年來，由于養(yǎng)殖量大大減少，驢肉供應量逐年降低，完全不能滿足火爆的市場需求， 價格更是不斷攀升。2014年元旦后的國際零售巨頭沃爾瑪"假驢肉口"事件并非特例，在 利益驅使下，部分餐館和不法商家為了謀權暴利，收購問題驢肉，采用向驢肉中滲雜廉價的 馬肉、狐貍肉等策略欺騙消費者，該種廉價原料經過深加工后，已無法從外觀上對其組成進 行鑒定。滲雜、滲假、W次充好等手段欺騙消費者謀權暴利現象目前在國內外均屢屢發(fā)生， 該種造假行為不僅僅設及經濟、法律、營養(yǎng)價值及宗教信仰問題，部分企業(yè)在狐貍肉處理過 程中，甚至加入合成色素或發(fā)色劑亞硝酸鹽一亞硝酸鹽可與食物或胃中的物質產生強致癌 作用，對人體健康存在極大威脅。因此，盡快建立可靠有效的驢、馬和狐貍源性檢測方法，對 于確保食品標簽真實準確，加強食品標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意 義。
[0003] 目前，食品中動物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學、免疫學和分子生物學方 法。其中尤W分子生物學方法最為快速、準確、穩(wěn)定、高效和靈敏。采用DNA分子水平的檢 測方法與蛋白質水平的檢測方法相比，目標DNA比較穩(wěn)定，不易受到外界環(huán)境及加工工藝 的影響，而蛋白質在高溫加工后構象會改變，不穩(wěn)定，每個物種不一致，鑒別起來困難，而且 DNA提取簡單，易操作。當前，基于DNA的檢測方法中，實時巧光PCR法W其操作簡便、靈敏、 特異、快速、重復性好、定量準確、閉管反應等優(yōu)點，得到研究者的普遍認可，成為檢測的重 要工具。
[0004] 鑒于線粒體基因組（mtDNA)結構比較簡單、穩(wěn)定、分子量小，每個細胞中有 1000-10000個拷貝，容易從組織中分離提取。大量研究證明，在動物種屬鑒定中mtDNA與 核DNA分子標記相比，具有靈敏度高、精確度好、快速、降解?。庸み^程中mtDNA保持較完 整）、穩(wěn)定容易操作等優(yōu)勢。在mtDNA中，leSrRNA基因是線粒體基因組中研究較多的基因， 為生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可變序列，其序列變化與進化距離相適 應，被稱為進化分子鐘?；趧游飉tDNA的PCR分子標記技術的上述特點，加之多重實時巧 光PCR的快速、靈敏、高通量等特點，其在動物源性成分鑒別檢測中具有廣泛的應用前景。
[0005] 此外，目前針對動物源性的巧光定量PCR檢測體系均缺乏內標（IAC)對反應體系 進行監(jiān)控，無法避免由反應抑制因素而造成假陰性結果的產生，導致檢測結果不準確。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒別驢、馬、狐貍動物源性的引物探針組合物，該引物探 針組合物能快速鑒別驢、馬、狐貍=種動物源性成分，特異性好，靈敏度高。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供含有上述引物探針組合物的PCR檢測試劑盒，該試劑盒 操作方便，不易污染，準確穩(wěn)定。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種多重實時巧光定量PCR檢測方法，該方法快速方 便，能有效指示假陰性出現，靈敏準確。
[0009] 本發(fā)明應用PCR技術及巧光探針進行核酸DNA分子標記技術，采用多重多色巧光 定量PCR檢測技術，實現驢、馬和狐貍3種動物源性成份的快速、準確定性檢測。引物和探 針是實現本發(fā)明的關鍵?；诰€粒體基因組具有靈敏度高、精確度好、快速、降解?。庸?過程中mtDNA保持較完整）、穩(wěn)定容易操作等優(yōu)勢，本發(fā)明W線粒體leSrRNA基因為祀基 因，根據NCBI數據庫分別下載驢、馬和狐貍的線粒體leSrRNA基因序列，應用同源分析工 具DNAMAN軟件對其同源性比對，根據篩選出的核屯、片段兩端相似的序列，利用引物設計 軟件Primer5. 0在高度保守區(qū)設計一對同時適合驢、馬和狐貍的PCR通用引物，再使用 Primer3. 0在可變區(qū)設計驢、馬和狐貍的3種化qMan特異探針。
[0010] 本發(fā)明設計的同時適合驢、馬、狐貍源性的通用引物如下： 上游引物；5'CGGGAATGACTAAATAAGACGA3' 下游引物：5'GGTCACCCCAACCGAAAT3'。 本發(fā)明設計的驢特異TaqMan探針（簡稱驢特異探針，下同）為： 5'TCAACATACAAACCTAACCCTCAGGGAC3'。 本發(fā)明設計的馬特異化qMan探針（簡稱馬特異探針，下同）為： 5'ACAACACACAAACCTAACCTTCAGGGACA3'。
[0011] 本發(fā)明設計的狐貍特異化qMan探針（簡稱狐貍特異探針，下同）為： 5'CCCCACTGGGAATAACATACTACCATTG3' 〇
[001引在PCR檢測時，因為多種因素容易出現PCR反應假陰性的現象，為了有效指示假陰 性，本發(fā)明還設計構建內標及其相應的內標化qMan探針（簡稱內標探針，下同），提高檢測 的準確性。內標的DNA序列如SEQIDN0;6 所示，為；CGGGAATGACTAAATAAGACGATGGAGCACGC CGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTCGGTTGGGGTGACC，共lOObp。 其構建方法為：使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒有出 現與之同源的DNA片段，在該段隨機DNA序列上下游連接上驢、馬和狐貍3個物種的通用引 物序列，從而形成該l(K)bp的內標DNA序列。在PCR體系使用時，內標W重組質粒的形式 加入PCR體系中，重組質粒為內標的DNA序列插入質粒PMD18-T中形成，其方法為；將該段 擴增內標序列委托人工基因合成，合成片段連接到載體PMD18-T，轉化感受態(tài)D冊a,質粒提 取，并測序驗證，得到能同時針對驢、馬和狐貍3個物種檢測體系的含有內標DNA的重組質 粒。
[0013]上述內標haMan探針為；5' -TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3'。
[0014] 本發(fā)明提供了一種能夠鑒別驢、馬、狐貍動物源性的組合物，該組合物包括上述一 對通用引物和上述驢、馬和狐貍特異化qMan探針。
[0015]進一步的，該組合物還包括上述內標和內標化qMan探針。其中，所述內標w重組 質粒的形式存在，所述重組質粒為上述將內標的DNA序列插入質粒PMD18-T中形成的含有 內標DNA的重組質粒。
[0016]本發(fā)明中，所述驢特異探針、馬特異探針、狐貍特異探針和內標探針的5'端均修飾 有報告基團，3'端均修飾有澤滅基團。所述報告基團可W為FAM、JOE、CY3、CY5等，所述澤 滅基團可W為TAMRA、B冊等。
[0017]本發(fā)明還提供了一種鑒別驢、馬、狐貍動物源性的PCR檢測試劑盒，該試劑盒中包 括；a. -對上述通用引物；b.驢、馬、狐貍3種特異化qMan探針；C.含有內標的重組質粒；d 內標化qMan探針。所述含有內標的重組質粒為內標DM序列與質粒重組得到的重組質粒。 所述質粒可W為PMD18-T。
[001引進一步的，本發(fā)明試劑盒中還可W包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、Taq酶和超純水。
[0019] 上述試劑盒中，各成分的用量可W參照現有技術中通用的用量規(guī)則來加入，例如 各引物加入量相同，各探針加入量也相同。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種鑒別驢、馬、狐貍動物源性的多重實時巧光定量PCR檢測方 法，該方法包括使用本發(fā)明鑒別驢、馬、狐貍動物源性的PCR檢測試劑盒，鑒別待檢樣本中 是否含有驢、馬、狐貍源性成分的步驟。
[0021] 上述多重實時巧光定量PCR檢測方法中，使用本發(fā)明試劑盒能夠同時鑒別待檢樣 本中是否含有驢、馬、狐貍源性成分。
[0022] 上述多重實時巧光定量PCR檢測方法中，具體包括W下步驟： (1) 提取待檢樣本的基因組DNA，備用； (2) 將提取的基因組DNA加入鑒別驢、馬、狐貍動物源性的PCR檢測試劑盒中，利用多重 實時巧光定量PCR法檢測； (3) 收集PCR擴增過程中的巧光信號，通過巧光信號鑒別待檢樣本中是否含有驢、馬、 狐貍源性成分。
[0023] 上述方法中，本領域技術人員可W按照現有技術中公開的方法和試劑盒提取待測 肉品的基因組DNA，該操作是容易實現的。
[0024] 上述方法中，所述待檢樣本可W為皮張、肉類及肉類加工品。
[002引在PCR檢測時，將試劑盒中的引物、探針、擴增內標等各種試劑加入一支巧光定量PCR反應管中，然后加入模板DNA形成巧光定量PCR反應體系。
[0026] 各種上述方法中，PCR擴增條件為；95°ClOmin預變性；95°C5s，63°C35s，在此收 集巧光信號，共計45個循環(huán)。
[0027] 上述方法中，優(yōu)先選用20y1的PCR擴增體系。
[0028] 上述方法中，按照W下方式判讀是否含有驢、馬、狐貍源性成分： a. 當相應的驢、馬、狐貍特異探針的巧光信號被檢出，且Ct值<35時，無論內標探針的 巧光信號是否被檢出（檢測樣品會抑制內標DNA的擴增），均表示待檢樣本中含有相應的動 物源性成分； b. 當內標