檢測(cè)braf基因突變的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及檢測(cè)BRAF基因突變的試劑盒，還設(shè)及利用該 試劑盒在非疾病診斷中檢測(cè)BRAF基因突變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] BRAF基因是Ras的下游基因，屬于RAF基因家族，定位于7q34，編碼的BRAF蛋白由 783個(gè)氨基酸組成，有CRUCR2和CR3S個(gè)保守區(qū)域，與BRAF蛋白同為Ras-Raf-MEK-E服信 號(hào)通路中上游重要調(diào)節(jié)因子。該酶將信號(hào)從Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEKl/2，MEKl/2再激活邸K1/2,激 活的ERK可影響核因子KB、細(xì)胞周期蛋白D1，使其表達(dá)增強(qiáng)。其中CR1區(qū)含有Ras蛋白結(jié) 合區(qū)和富含半脫氨酸區(qū)，CR3區(qū)為ATP結(jié)合位點(diǎn)和激活區(qū)，有多個(gè)磯酸化位點(diǎn)，其中T598和 S601最為重要，該兩個(gè)磯酸化位點(diǎn)同時(shí)活化后，可激活BRAF蛋白和誘導(dǎo)性激活ERK，而該兩 個(gè)位點(diǎn)氨基酸的改變將導(dǎo)致BRAF蛋白的持續(xù)激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞調(diào)亡，使 血管生成因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體表達(dá)增加，促進(jìn)血管生成，可使0整合素表達(dá)增加， 促進(jìn)組織侵襲和遷移。BRAF基因90%的突變集中在編碼部分CR3激活區(qū)的15號(hào)外顯子中， 該些突變位點(diǎn)大多為1799核巧酸T突變?yōu)锳，導(dǎo)致谷氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸（V600E)。BRAF基 因突變導(dǎo)致Raf激酶的活性大力增加并活化下游激酶化k，MAPK通路持續(xù)激活，使前有絲分 裂原有效分裂能力增強(qiáng)，同時(shí)抑制促調(diào)亡因子BIM，引起細(xì)胞異常增殖分化。
[0003] 結(jié)直腸癌（CRC)是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率在我國(guó)呈逐年上 升之勢(shì)，患者中約15%的患者BRAF基因發(fā)生了突變。國(guó)內(nèi)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大約65%的結(jié)直腸 癌與BARF基因突變有關(guān)，BARF基因突變后，產(chǎn)生MAPK信號(hào)通路的持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖 和分化。免疫組化研究結(jié)果顯示，BARF蛋白在結(jié)直腸癌中高度表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)到80%，且低 分化癌的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于高分化癌，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的表達(dá)模式符合"增生性息肉-銀齒狀 腺瘤-癌"遞增趨勢(shì)。
[0004] 目前，結(jié)直腸癌的治療方式主要W手術(shù)方式為主，W化學(xué)藥物治療和放射性治療 為輔助療法。隨著生物與醫(yī)學(xué)相關(guān)科學(xué)的發(fā)展，結(jié)直腸癌治療中的分子祀向藥物和祀向預(yù) 測(cè)指標(biāo)越來(lái)越受到重視，并逐漸將結(jié)果運(yùn)用到臨床治療之中。2009年，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng) 絡(luò)（^tionalComprehensiveCancerNetwork,NCCN)公布了已被證實(shí)的結(jié)直腸癌個(gè)體化 治療的相關(guān)藥物與檢測(cè)祀標(biāo)，與其相關(guān)的祀向治療藥物為西妥昔單抗和帕巧單抗。
[0005] 西妥昔單抗是嵌合型抗體，與BRAF能夠特異性結(jié)合，W阻止EGF激活受體，抑制下 游信號(hào)向BRAF傳遞，從而干擾腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、遷移、細(xì)胞修復(fù)和血管生成。與帕巧單抗的 區(qū)別在于，后者是完全人源化的單克隆抗體，臨床中，可W在提供有效治療的同時(shí)減少免疫 應(yīng)答反應(yīng)，較少發(fā)生輸液反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。然而，隨著對(duì)西妥昔單抗研究的不斷 深入，西妥昔單抗的使用受限于BRAF基因?yàn)橐吧偷幕颊?，而且BARF基因中不能存在特殊 突變，否則抗BRAF的治療無(wú)效。因此，2010年NCCN的結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南中，推薦在使 用抗BRAF單克隆抗體進(jìn)行治療之前，要增加對(duì)BRAF基因野生型患者的BARF基因突變的檢 巧。，對(duì)于存在BARF基因中存在V600E突變的患者，不推薦使用抗BRAF單克隆抗體進(jìn)行治 療。因此，BRAF基因是一個(gè)很好的早期預(yù)防及治療結(jié)直腸癌的祀點(diǎn)。
[0006] 各種來(lái)源的結(jié)直腸癌組織是檢測(cè)突變的最佳樣本，但部分中晚期患者難W得到較 佳的病理組織，檢測(cè)血漿中來(lái)自腫瘤的DNA是否有突變是一種趨勢(shì)。腫瘤患者的血漿循環(huán) DNA，亦稱非細(xì)胞游離DNA(ceU-化eeDNA，C巧NA)中包含腫瘤起源的DNA，與原發(fā)腫瘤基因 組DNA具有相同的遺傳特征。腫瘤rfDNA包括來(lái)源于正常細(xì)胞的野生型DNA和腫瘤細(xì)胞 DNA，多項(xiàng)研究表明腫瘤患者血漿中可W檢測(cè)到與自身腫瘤相一致的DNA突變。
[0007] 因此，檢測(cè)組織或血漿BRAF基因突變對(duì)于指導(dǎo)CRC病人臨床用藥，具有重要的參 考價(jià)值。
[000引 目前檢測(cè)基因突變的方法主要有W下幾種：
[0009] (1)直接測(cè)序法。直接測(cè)序法的原理是；首先針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針（每個(gè)基因設(shè) 計(jì)一對(duì)探針，探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的產(chǎn)物盡可能的包含突變位點(diǎn)所在的位置），然后通過(guò)簡(jiǎn)單PCR擴(kuò) 增獲得目的基因產(chǎn)物，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并且對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步分析。初步分析 完成后，對(duì)一些可能的突變樣品的PCR產(chǎn)物，需要對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收；回收后的PCR 產(chǎn)物連接克隆載體；挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。此過(guò)程比較繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)， 而且由于測(cè)序方法本身的限制導(dǎo)致其靈敏度不高，只能對(duì)含量大于20%的基因突變進(jìn)行檢 巧。。因此，此法不適合在臨床中的應(yīng)用與大量的臨床樣本分析。
[0010] 似變性高效液相色譜法（denaturinghi曲-performanceliquid c虹omatograph，DHPLC)。該方法的原理是基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合 雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開(kāi)。由于雜合雙鏈在突變位點(diǎn)處出現(xiàn)錯(cuò)配，更易于形 成"Y"形結(jié)構(gòu)，與固定相的結(jié)合能力降低，因此雜合DNA鏈要比純合DNA鏈優(yōu)先洗脫出來(lái)， 通過(guò)洗脫峰的不同判斷有無(wú)突變存在。DHPLC可檢測(cè)出含有單個(gè)檢測(cè)的突變、插入或者缺失 的異源雙鏈片段。該法對(duì)已知和未知的突變位點(diǎn)均可W檢測(cè)，敏感性在5%左右，但檢測(cè)過(guò) 程中需要打開(kāi)反應(yīng)管，容易造成污染，而且陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)其具體未知，最終還需測(cè)序確 認(rèn)。
[0011] (3)高分辨率溶解曲線化i曲resolutionmelting,HRM)。高分辨率溶解曲線是 基于核酸的物理性質(zhì)，通過(guò)飽和染料結(jié)合于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，監(jiān)控產(chǎn)物烙解曲線的變化分析 基因突變。檢測(cè)敏感性在5%左右，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果并不能確定其具體位置，最終還需要通過(guò) 測(cè)序加W確認(rèn)。
[001引 （4)探針擴(kuò)增阻滯突變法（amplificationrefractoiymutationsystem,ARM巧。 利用PCR探針的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)針對(duì)突變 位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增探針，在嚴(yán)格的條件下，只有在探針3'堿基與模板配對(duì)時(shí)PCR擴(kuò)增 反應(yīng)才能正常進(jìn)行，從而檢測(cè)出突變。通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5'端探針，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè) 與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純和性突變，分別加入兩種探針及3'端探針進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR，結(jié) 合有與突變DNA完全互補(bǔ)的探針才可W延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該檢測(cè)方法的靈敏度在 1%左右。
[0013] (5)等位基因特異的"Tagman聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（competitiveallele-specific "TagManpolymerasechainreaction,CAST-PCR)。CAST-PCR法義用優(yōu)化"TagMan探針，通 過(guò)一段特異設(shè)計(jì)的MGB探針來(lái)阻止探針與野生型DNA結(jié)合，選擇性的優(yōu)先擴(kuò)增突變型DM， 該檢測(cè)方法的靈敏度在1-0. 1%左右。
[0014] 因此，急需一種提高檢測(cè)BRAF基因的靈敏度的方法和相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，為結(jié)直 腸癌個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)BRAF基因突變的試劑盒，該試劑盒特異性 強(qiáng)且靈敏度高；本發(fā)明的目的之二在于提供檢測(cè)BRAF基因突變方法，該方法檢測(cè)周期短。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0017] 1、檢測(cè)BRAF基因突變的試劑盒，所述試劑盒含有針對(duì)BRAF基因V600E突變位點(diǎn) 的LNA鎖核酸修飾的特異探針。
[001引優(yōu)選的，所述LNA鎖核酸修飾的特異探針的核巧酸序列為CAG+TGA+AA+TC+TC+GA+TGGAG-P04,其中"+ "后的T，A或G表示鎖核酸修飾的堿基。
[0019] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包含檢測(cè)BRAF基因突變的引物，所述引物的核巧酸序列 如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
[0020] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括PCR緩沖液、dNTPs、EvaGreen和二氯化儀。
[002U 優(yōu)選的，所述試劑盒中各組分的終濃度如下；IXPCR buffer、2.5mMMgCl2、dNTP 250yM、引物 250nM、探針 500nM、1X EVE GREEN、DM聚合酶lU和DM模板 2 ~20ng。
[0022] 2、所述檢測(cè)BRAF基因突變的試劑盒在非疾病診斷中檢測(cè)BRA