蛋白質生產(chǎn)促進劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)，特別地，涉及適合用于通過動物細胞(例如CH0細胞)高生產(chǎn) 蛋白質的蛋白質生產(chǎn)促進劑和含有所述促進劑的培養(yǎng)基。此外，本發(fā)明涉及使用所述蛋白 質培養(yǎng)促進劑和含有所述促進劑的培養(yǎng)基的蛋白質生產(chǎn)方法。 技術背景
[0002] 近年來，在生命科學領域，通過大量培養(yǎng)生產(chǎn)有用蛋白質的動物細胞在工業(yè)水平 生產(chǎn)目標的有用蛋白質變得非常重要。當天然或重組蛋白質等通過培養(yǎng)所述動物細胞或導 入編碼期望蛋白質的基因的動物細胞生產(chǎn)時，為了所述動物細胞的生長，在基本營養(yǎng)物(諸 如鹽、糖類、氨基酸、維他命等）以外使用動物細胞生長因子。作為動物細胞生長因子，血清 組分諸如胎牛血清、小牛血清等是通常使用的。通常的，當使用胎牛血清或小牛血清時，其 需要以約5-20%體積添加至基礎培養(yǎng)基。
[0003] 然而，諸如胎牛血清、小牛血清等的血清受到供應限制并且通常非常昂貴。這導致 有用蛋白質的生產(chǎn)成本的增加。
[0004] 此外，來自哺乳動物來源的生長因子和血清存在問題，因為它們涉及瘋牛 病、牛綿狀腦病、傳染性海綿狀腦病，和進一步的，朊病毒相關疾病諸如克雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)，并且來自哺乳動物的血清可以被病毒或支原體污染，因為 其不能在高壓滅菌器等中滅菌。因此，從安全方面，已經(jīng)發(fā)展出無血清培養(yǎng)方法，其中動物 細胞培養(yǎng)在不含血清的環(huán)境中。在無血清培養(yǎng)方法中，使用天然存在的純化的蛋白質，諸如 胰島素、轉鐵蛋白、生長因子等，重組蛋白質等作為血清(血清替代物)效果的替代品。然而， 這些蛋白質通常比胎牛血清或小牛血清更加昂貴，并且其供應受到限制。
[0005] 如上文提及的，因為血清和血清代替物是昂貴的，并且其供應受到限制，因此期望 發(fā)展用于仍更高效地生產(chǎn)有用蛋白質的技術。
[0006] 發(fā)明概述 通過本發(fā)明解決的問題 本發(fā)明的問題是提供蛋白質生產(chǎn)促進劑，用于通過使用動物細胞生產(chǎn)期望的蛋白質。 本發(fā)明的進一步的問題是提供通過使用含有所述蛋白質生產(chǎn)促進劑的培養(yǎng)基的蛋白質生 產(chǎn)方法。
[0007] 解決問題的方法 本發(fā)明人已進行了深入研宄以試圖解決上文提及的問題并且發(fā)現(xiàn)向用于動物細胞的 含有血清或血清替代物的培養(yǎng)基添加多糖顯著地增加了期望的蛋白質生產(chǎn)的量，這導致了 本發(fā)明的完成。
[0008] 因此，本發(fā)明涉及以下[1]至[15]。
[0009] [1]用于動物細胞的培養(yǎng)基添加物，其包含多糖。
[0010] [2] [1]的添加物，所述添加物通過培養(yǎng)的動物細胞促進期望的蛋白質的生產(chǎn)。
[0011] [3] [2]的添加物，所述添加物促進上文所述動物細胞的每一個細胞的蛋白質生 產(chǎn)。
[0012] [4] [1]的添加物，其中上文所述多糖具有陰離子官能團。
[0013] [5] [4]的添加物，其中上文所述陰離子官能團選自羧基、磺酸基和磷酸基中至少 一種。
[0014] [6] [5]的添加物，其中上文所述多糖選自透明質酸、結冷膠、脫?；Y冷膠、黃原 膠、角叉菜膠、迪特膠、藻酸、巖藻依聚糖、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫 酸類肝素、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李糖聚糖及其鹽中至少一種。
[0015] [7] [6]的添加物，其中上文所述多糖是脫?；Y冷膠或其鹽。
[0016] [8]用于動物細胞的培養(yǎng)基，其包含根據(jù)[1]至[7]中任一項的所述添加物。
[0017] [9] [8]的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基具有不低于1% (w/v)并且不高于15%(w/v)的血 清濃度。
[0018] [10] [8]的培養(yǎng)基，具有血清替代物的濃度不低于1% (w/v)并且不高于15%(w/ v)，其中所述血清替代物選自血漿蛋白質、激素、生長因子和鹽。
[0019] [11] [8]至[10]中任一項的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基進一步包含選自氨基酸、維他 命、能源、滲透壓調節(jié)劑、鐵源和pH緩沖液中的至少一種。
[0020] [12]通過使用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質的方法，所述方法包括在[1]至[7]中任 一項的添加物的存在下或在根據(jù)[8]至[11]中任一項的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述動物細胞。
[0021] [13] [12]的方法，其中所述動物細胞在至少（a)或（b)時期培養(yǎng)： (a) 當所述培養(yǎng)的動物細胞可以充分地生長的部分或全部時期， (b) 當所述動物細胞可以充分地生產(chǎn)期望的蛋白質的部分或全部時期。
[0022] [14]促進在培養(yǎng)基中的細胞生產(chǎn)的蛋白質的量的方法，其包括在[1]至[7]中任 一項的添加物的存在下或在根據(jù)[8]至[11]中任一項的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述動物細胞。
[0023] [15] [14]的方法，所述方法促進所述動物細胞的每一個細胞的生產(chǎn)的蛋白質的 量。
[0024] 本發(fā)明效果 本發(fā)明用于動物細胞的培養(yǎng)基添加物可以增加期望的蛋白質的生產(chǎn)量，當將所述添加 物添加至用于動物細胞的培養(yǎng)基時，能夠生產(chǎn)蛋白質的動物細胞使用獲得的培養(yǎng)基培養(yǎng)， 并且從培養(yǎng)基和/或動物細胞中收集生產(chǎn)的蛋白質。特別地，所述添加物可以增加每一個 細胞生產(chǎn)的蛋白質的量。
[0025] 此外，因為本發(fā)明用于動物細胞的培養(yǎng)基添加物可以通過簡單地添加至培養(yǎng)基促 進期望蛋白質的生產(chǎn)量，其在操作和處理方面是有優(yōu)勢的。
[0026] 此外，因為所述添加物可以更高效地生產(chǎn)期望的蛋白質，所以其同樣在生產(chǎn)成本 方面是有優(yōu)勢的，并且可以極大地有助于，例如，生物制藥產(chǎn)品（諸如抗體藥物等）的大量供 應等。
[0027] 附圖簡述 圖1顯示當人骨髓瘤源細胞系SC-01MFP在脫?；Y冷膠（0. 015%)存在和其不存在(對 照）的情況下培養(yǎng)時，細胞數(shù)量的增加和A鏈生產(chǎn)量的比較。
[0028] 圖2顯示在脫酰基結冷膠（0. 015%)存在下和如圖1中對照存在下A鏈生產(chǎn)量在 圖中面積的比較，其中A鏈生產(chǎn)量在圖中的面積使用細胞數(shù)量增加在圖中的面積進行修 正，通過梯形試樣法計算當SC-01MFP培養(yǎng)于脫?；Y冷膠存在（0. 015%)和其不存在(對 照）情況下時，細胞數(shù)量增加（左圖）和A鏈生產(chǎn)量(右圖）的圖中面積獲得所述修正，在測 試中使用圖1中描述的SC-01MFP (圖中A鏈生產(chǎn)量面積/圖中細胞數(shù)量增加面積)。
[0029] 圖3顯示了當在存在脫?；Y冷膠（0. 025%)和其不存在(對照）的情況下培養(yǎng)通 過將人干擾素0 (IFN-0 )基因摻入CH0-K1中獲得的中國倉鼠卵巢源細胞系（CH0-K1)時， 細胞數(shù)量增加和IFN-0產(chǎn)量的比較。
[0030] 圖4顯示在脫?；Y冷膠（0. 025%)存在下和如圖1中對照存在下IFN-0生產(chǎn)量 在圖中面