鼠疫疫苗的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本申請涉及尤其用于抗淋巴腺鼠疫和抗肺鼠疫的疫苗接種的方法，以及 涉及其生物技術(shù)和醫(yī)學應用。本申請的方法尤其包含假結(jié)核耶爾森菌（Yersinia pseudotuberculosis)細胞或者株，其表達至少一種鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis)Cafl 多肽或者鼠疫耶爾森菌Can的至少一種抗原性片段。更具體地，本申請的方法包含假結(jié)核 耶爾森菌細胞或株，其表達鼠疫耶爾森菌F1蛋白或者莢膜。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠疫耶爾森菌，鼠疫的病原體，是影響人類的最致命傳染性病原體之一。鼠疫耶爾 森菌通過被感染的跳蚤進行傳播，其主要引起淋巴腺鼠疫。這種疾病偶爾發(fā)展成肺鼠疫，這 是感染的最致命且最具傳染性的形式，其然后通過氣溶膠進行人之間的傳播。
[0003] 自九十年代初，鼠疫已經(jīng)被列入重新出現(xiàn)的疾病名單，并且鼠疫耶爾森菌被列為 潛在的恐怖分子使用的生物武器。由于已經(jīng)觀察到鼠疫耶爾森菌的抗生素耐受株或者可以 經(jīng)過工程改造用于犯罪用途，抗鼠疫的疫苗接種可能成為對抗疾病的唯一手段。
[0004] 近年來，所做的努力大多集中在組合莢膜F1抗原和V抗原（LcrV)的亞單位制劑。 然而，這種疫苗需要使用佐劑和重復注射，以賦予主要為抗體依賴性的保護。
[0005] 其它策略包括通過遺傳工程對活鼠疫耶爾森菌進行減毒、在沙門氏菌或者病毒載 體中引入鼠疫耶爾森菌抗原、以及DNA疫苗接種。
[0006] 然而，這些疫苗不夠安全和/或高效對抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫。
[0007] Derbise等人2012 [參考文獻（1)]，發(fā)表于2012年2月14日，描述了抗鼠疫活疫 苗的構(gòu)建。更精確地說，它描述了鼠疫耶爾森菌caf操縱子（所述caf?操縱子編碼用于表 面表達低聚鼠疫耶爾森菌F1抗原）的克隆，以及將所述操縱子插入到質(zhì)粒上用于電穿孔到 假結(jié)核耶爾森菌的減毒株中。在所得的假結(jié)核耶爾森菌株（株V674pFl)中，編碼用于表面 表達鼠疫耶爾森菌F1單體單元（即，至少Cafl多肽）的核酸包含在所述質(zhì)粒中。
[0008] 在本申請的假結(jié)核耶爾森菌細胞或株中，編碼用于表面表達Cafl多肽的核酸包 含在所述假結(jié)核耶爾森菌細胞或者株的染色體中。本申請顯示出非常高的抗淋巴腺鼠疫和 肺鼠疫的疫苗接種效果。本申請還提供了比較實驗數(shù)據(jù)，其尤其顯示出本申請的細胞或者 株比Derbise等人2012中描述的V674pFl株更高效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本申請涉及提交的權(quán)利要求中所限定的以及如此處所述的主題。
[0010] 更具體地，本申請涉及細胞、株、組合物、藥物組合物、免疫原性組合物、疫苗、及其 生物技術(shù)和醫(yī)學應用，更具體地涉及其體外和體內(nèi)應用，更具體地涉及其免疫原性和/或 疫苗應用。
[0011] 本申請的細胞是假結(jié)核耶爾森菌細胞，更具體地一種重組假結(jié)核耶爾森菌細胞。
[0012] 當用于治療目的時，本申請的假結(jié)核耶爾森菌細胞是無毒力的，更具體地是減毒 的，更具體地是遺傳減毒的。
[0013] 本申請的假結(jié)核耶爾森菌細胞包含編碼至少一種鼠疫耶爾森菌Cafl多肽或鼠疫 耶爾森菌Cafl的至少一種抗原性片段的核酸。更具體地，所述核酸編碼鼠疫耶爾森菌F1 蛋白，更具體地編碼鼠疫耶爾森菌的莢膜。
[0014] 所述編碼核酸被包含在，更具體而言被整合到本申請假結(jié)核耶爾森菌細胞的染色 體中。
[0015] 本申請的細胞尤其用作抗鼠疫的免疫原，更具體地抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的免疫 原。
[0016] 所述編碼核酸的染色體插入出乎意料地導致更高水平的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫 的保護，更具體地是抗淋巴腺鼠疫。
[0017] 本申請的遺傳減毒的假結(jié)核耶爾森菌尤其具有以下優(yōu)點：
[0018] -遺傳穩(wěn)定性：所述假結(jié)核耶爾森菌細胞的基因組比鼠疫耶爾森菌的基因組更穩(wěn) 定；
[0019] -無毒：所述假結(jié)核耶爾森菌細胞可以是高度減毒的，例如通過（部分或者完全） 刪除一個或更多毒力機制所必須的基因，更具體地，不同毒力機制所必須的三個基因；
[0020] -分子多樣性：當用作活的全細胞疫苗時，它提供高的抗原性復雜性，這保證了對 抗廣泛抗原性靶的反應；只要細菌存在，抗原就以其天然形式被充分加工并從頭生產(chǎn)；
[0021] _容易制造：一旦開發(fā)和驗證，活疫苗并不需要生產(chǎn)復雜的設備和技術(shù)；
[0022] -免疫原性：因為細菌抗原（LPS和其它病原體相關(guān)的標志（signatures))觸發(fā)固 有免疫系統(tǒng)，因此不需要佐劑；除了鼠疫耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌的常見抗原，所述假結(jié) 核耶爾森菌細胞可以穩(wěn)定地生產(chǎn)鼠疫耶爾森菌F1莢膜，這是抗鼠疫耶爾森菌的主要疫苗 靶；
[0023] _單劑量施用：這是一個主要的優(yōu)勢，因為它極大地方便了疫苗接種活動并允許 快速保護；
[0024]-能夠通過兩種途徑進行疫苗接種：根據(jù)上下文，優(yōu)選皮下或者口服途徑的疫苗 接種。
[0025] 本發(fā)明人認為，通過本申請的方法所達到的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保護水平是 以往報道的最高效之一，并且可能是最高效的。
【附圖說明】
[0026] 圖1:重組質(zhì)粒pUC18R6KTn7-caf-CmK的遺傳圖譜，其攜帶插入在Tn7迷你轉(zhuǎn)座子 中的caf操縱子[caflM、caflA和cafl (在作為調(diào)控序列的caflR的控制下）]。
[0027] 圖2:整合到減毒假結(jié)核耶爾森菌株染色體中的迷你Tn7-caf-CmK轉(zhuǎn)座子的遺傳 圖譜。
[0028] 圖3 :檢測減毒假結(jié)核耶爾森菌株的鼠疫耶爾森菌F1生產(chǎn)，其中caf操縱子已被 插入到基因組中（株V674TnFl)。V674是不具有caf操縱子的親本株。C092是用于克隆 caf操縱子的鼠疫耶爾森菌株。
[0029]圖4:檢測包圍減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞的F1莢膜，所述減毒假結(jié)核耶爾森菌細 胞包含在質(zhì)粒上的（假結(jié)核耶爾森菌株V674pFl;左圖）或者插入到染色體中的（假結(jié)核 耶爾森菌V674TnFl;右圖）鼠疫耶爾森菌caf操縱子。在V674pFl中，許多細菌未被莢膜 包圍（一些實例用箭頭顯示），而所有V674TnFl細胞均被包囊。
[0030] 圖5A、5B和5C :攜帶鼠疫耶爾森菌caf操縱子的減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞，存在 于口服疫苗接種有1〇8或者10 9CFU的小鼠腸道菌群（圖5A)、派伊爾斑（peyer' s patches) (圖5B)和脾臟（圖5C)中。
[0031] 方形=減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞，其中鼠疫耶爾森菌caf操縱子攜帶在質(zhì)粒上 (假結(jié)核耶爾森菌株V674pFl)。
[0032] 三角形=減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞，其中鼠疫耶爾森菌caf操縱子被插入到染色 體中（假結(jié)核耶爾森菌株V674TnFl)。
[0033] 圖6A和6B :用鼠疫耶爾森菌（肺鼠疫）進行中度（圖6A)或者重度（圖6B)鼻 內(nèi)攻擊后，單次口服疫苗接種減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞所賦予的抗肺鼠疫保護，其中減毒 假結(jié)核耶爾森菌細胞將鼠疫耶爾森菌caf操縱子攜帶在質(zhì)粒上（株V674pFl)或者插入到 染色體中（株V674TnFl)。
[0034] 圖7A和7B:用鼠疫耶爾森菌（淋巴腺鼠疫）進行中度（A)或者重度⑶皮下攻 擊后，單次口服疫苗接種減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞所賦予的抗淋巴腺鼠疫保護，其中減毒 假結(jié)核耶爾森菌細胞將鼠疫耶爾森菌caf操縱子攜帶在質(zhì)粒上（株V674pFl)或者插入到 染色體中（株V674TnFl)。
[0035] 圖8 :采用鼠疫耶爾森菌（株C092)進行重度攻擊，單次皮下接種107或者10 8CFU 減毒假結(jié)核耶爾森菌細胞所賦予的抗淋巴腺鼠疫（皮下感染）的保護，其中鼠疫耶爾森菌 caf操縱子插入到染色體中（株V674TnFl)。
[0036] 圖9:采用鼠疫耶爾森菌（株C092)進行重度攻擊，單次皮下接種各種劑量的減毒 假結(jié)核耶爾森菌細胞所賦予的抗肺鼠疫（鼻內(nèi)感染）的保護，其中鼠疫耶爾森菌caf操縱 子插入到染色體中（株V674TnFl)。
【具體實施方式】
[0037] 本申請涉及假結(jié)核耶爾森菌細胞。
[0038] 所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是重組細胞。
[0039] 所述假結(jié)核耶爾森菌細胞可以是任何血清型，例如血清型I、II、III、IV或者V，例 如血清型I。所述假結(jié)核耶爾森菌細胞可以是任何假結(jié)核耶爾森菌株的細胞。
[0040] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞或者株是血清型I。
[0041] 假結(jié)核耶爾森菌株是本領域普通技術(shù)人員可獲得的，例如來自微生物的采集（例 如，CRBIP、DSMZ、ATCC、NCTC)、來自商業(yè)來源或者通過分離自污染的生物材料（如來自污染 的水或者土壤）或者來自污染的有機體（如被感染的人或者被感染的非人動物）。
[0042] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞或者株是來自耶爾森菌研宄單 位和國家參考實驗室（Yersinia Research Unit and National Reference Laboratory) 收集的假結(jié)核耶爾森菌IP32953 (以登錄號NC_006155,更具體地NC_006155. 1，可以獲得株 IP32953的基因組序列）。
[0043] 假結(jié)核耶爾森菌是腸病原體。假結(jié)核耶爾森菌感染（或假結(jié)核病）導致急性消化 性疾病，有時隨后是敗血癥，以及有時但很少見的是關(guān)節(jié)和/或皮膚癥狀。
[0044] 人類感染假結(jié)核耶爾森菌通常會導致腸胃炎。在一些國家如俄羅斯和日本，假結(jié) 核耶爾森菌的特定株引起遠東猩紅樣發(fā)熱（FESLF)，其特點是紅斑皮瘆、脫肩、瘆子、舌頭充 血、反應性關(guān)節(jié)炎、中毒性休克綜合征、敗血癥。
[0045] 在非人動物中，假結(jié)核耶爾森菌是發(fā)病率以及有時是死亡率的常見原因。
[0046] 因此，當本申請的假結(jié)核耶爾森菌細胞意圖用于治療性應用時，它是（或已經(jīng)制 成）無毒力的，即無論對于接受者還是對于接受者的任何接觸而言，所述假結(jié)核耶爾森菌 細胞是足以安全地用于沒有任何臨床感染危險的施用。換句話說，假如不能完全消除與施 用所述假結(jié)核耶爾森菌相關(guān)的風險，則其被最小化。
[0047] 更具體地，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞已喪失導致假結(jié)核病的能力，更通常而言已 喪失導致腸疾病和敗血癥的能力。
[0048] 根據(jù)本申請的實施方式，所述無毒力的假結(jié)核耶爾森菌細胞仍然能夠生長，更具 體而言能夠在宿主有機體（如人或者非人的哺乳動物）中復制，但是已經(jīng)喪失在所述宿主 有機體中導致所述疾病的能力。
[0049] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞對于健康哺乳動物，更具體而 言對于健康人類，是無毒力的。
[0050] 所述假結(jié)核耶爾森菌細胞可以是天然無毒力的，或者它可以通過遺傳和/或化學 減毒而成為無毒力的。
[0051] 致病性細菌的減毒方法是本領域已知的?？梢酝ㄟ^失活一個或更多參與細菌代謝 途徑的基因，更具體地通過失活一種或更多細菌致病性機制，和/或通過失活一個或更多 參與或者負責產(chǎn)生細菌毒力因子的基因，來實現(xiàn)遺傳減毒。
[0052] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是遺傳減毒的。
[0053] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是不可逆減毒的。
[0054] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是遺傳地且不可逆地減毒的。
[0055] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是通過部分或者完全刪除一個 或者更多基因而減毒的，更具體而言通過部分或者完全刪除一個或者更多參與或者負責產(chǎn) 生假結(jié)核耶爾森菌毒力因子的基因而減毒的。這樣的基因包括高致病島基因（HPI)、yopK 基因和psaA基因。
[0056] 例如通過同源重組隨后的等位基因交換能夠?qū)崿F(xiàn)基因的部分或者完全刪除（參 見參考文獻（1)和（8)，即Derbise等人2012和2003)。
[0057] 部分刪除實現(xiàn)到足以失活基因功能的程度。
[0058] 根據(jù)本申請的實施方式，所述假結(jié)核耶爾森菌細胞是通過部分或者完全刪除一個 或