用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法
[0001] 本發(fā)明公開(kāi)涉及用于增加使用DNA序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞數(shù)量的方法，其中所 述的DNA序列編碼目的蛋白質(zhì)并且能夠表達(dá)該蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明公開(kāi)還涉及使用本文 所述的方法制備的宿主細(xì)胞以及在該方法中使用的多核苷酸序列，例如RNA或DNA，特別是 質(zhì)粒DNA。
【背景技術(shù)】
[0002] "經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為用于生產(chǎn)臨床用途的重組蛋白質(zhì)的主要系統(tǒng)， 由于其具有合適的蛋白質(zhì)折疊、組裝和翻譯后修飾的能力。因此，與其他宿主（例如細(xì)菌、 植物和酵母菌）相比，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)的品質(zhì)和效力都可以是 優(yōu)異的。
[0003] 當(dāng)今，所有重組蛋白質(zhì)藥物的大約60-70%都是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的。此外， 估計(jì)而言目前有幾百種臨床候選蛋白質(zhì)在公司的籌備中。這些蛋白質(zhì)中，許多都是在永生 化的中國(guó)倉(cāng)鼠卵（CH0)細(xì)胞中表達(dá)的，但是其他的細(xì)胞系（例如由小鼠骨髓瘤（NS0)細(xì)胞、 幼侖鼠腎（BHK)細(xì)胞、人胚腎（HEK-293)細(xì)胞和人視網(wǎng)膜細(xì)胞衍生的那些）也獲得了用于 重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。盡管用于生物藥物生產(chǎn)的大部分當(dāng)今的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 培養(yǎng)工藝是基于在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞，但是人工制造方法的多樣性是值得考慮的。
[0004] 最初，將具有必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的重組基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此外，轉(zhuǎn)移可賦予受 體細(xì)胞以選擇有利性的第二基因。在選擇試劑（在基因轉(zhuǎn)移后幾天加入）存在下，僅那些表 達(dá)選擇子基因的細(xì)胞存活。用于選擇的最普通的基因?yàn)槎淙~酸還原酶OHFR)(其為與核 苷酸代謝有關(guān)的酶）和谷氨酰胺合成酶（GS)。在這兩種情況下，在合適的代謝物（在DHFR 的情況下為次黃嘌呤和胸苷，在GS的情況下為谷氨酰胺）缺失的情況下發(fā)生選擇，從而阻 止非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)。通常，為了重組蛋白質(zhì)的有效表達(dá)，編碼生物藥物的基因和選擇子基 因是否在相同的質(zhì)粒上表達(dá)是不重要的。
[0005] 在選擇后，將存活者以單一細(xì)胞的形式轉(zhuǎn)移至第二培養(yǎng)容器中，并且擴(kuò)增培養(yǎng)物， 從而生產(chǎn)克隆群體。最后，針對(duì)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)單個(gè)克隆，其中最高的生產(chǎn)者被保 留用于進(jìn)一步的培養(yǎng)和分析。由這些候選物中選擇具有合適生長(zhǎng)和生產(chǎn)率特征的一個(gè)細(xì)胞 系用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。然后，建立培養(yǎng)工藝，該工藝由生產(chǎn)需要來(lái)確定。至此，所有哺乳 動(dòng)物重組治療為天然分泌的蛋白質(zhì)或者由介導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的基因構(gòu)建體研發(fā)得到。"
[0006] 上文摘錄自2004年出版的Nature綜述文章（Florian Wurm Nature Biotechnology Vol 22Number llNovember 2004, page 1393-1398)。在 2012 年，工藝與上 文所述的2004年出版的工藝基本上未發(fā)生改變。
[0007] 該Nature Biothechnology綜述討論了隨機(jī)插入至宿主細(xì)胞基因組中的缺點(diǎn)，并 且他們聲稱事實(shí)上在轉(zhuǎn)基因插入至細(xì)胞基因組的某些部分（例如被稱為異染色質(zhì)的DNA的 高度螺旋形式）中的情況下，很少或未獲得轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
[0008] 即使在異源基因插入至基因組的允許區(qū)域中，例如被稱為常染色質(zhì)的不緊密包裝 的DNA，相鄰的基因仍可以發(fā)揮不利的影響，并因此可以使基因滅活。
[0009] Nature綜述文章中繼續(xù)宣稱：已經(jīng)研發(fā)多種策略來(lái)克服隨機(jī)整合的不利的位置 影響。保護(hù)性順式調(diào)節(jié)元件包含絕緣子、邊界元件、支架/基質(zhì)附著區(qū)域、泛染色質(zhì)開(kāi)放元 件和保守的抗阻遏子元件。具有這些元件的側(cè)翼轉(zhuǎn)基因降低異染色質(zhì)的影響并允許轉(zhuǎn)基因 穩(wěn)定地表達(dá)。用于抑制沉默的另一種方式是使用丁酸酯阻斷組蛋白的脫乙酰作用。靶向轉(zhuǎn) 基因整合至基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域是避免位置影響的另一種可能的策略，并且近年來(lái)在討 論會(huì)上的陳述已經(jīng)暗示了基因靶向在工業(yè)中的用途。"
[0010] 在本領(lǐng)域中的一些人員致力于靶向整合，有時(shí)稱為同源重組，但是這需要良好地 了解宿主細(xì)胞的基因組，并且在沒(méi)有得到酶的進(jìn)一步幫助下，這些事件相對(duì)少見(jiàn)。
[0011] 用于制造目的的合適克隆的生成通常需要大量的篩選和費(fèi)力的尋找，例如可能需 要分析1500個(gè)克隆以識(shí)別適用于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的一個(gè)克隆。
[0012] 本發(fā)明人意外地建立了使用編碼目的蛋白質(zhì)和NHEJ蛋白質(zhì)（例如Ku70、Ku80、其 組合或其功能片段，或者編碼它們的序列）的DNA序列共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞得以產(chǎn)生能夠表達(dá) 目的蛋白質(zhì)的更多的細(xì)胞。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 因此，提供了使用NHEJ蛋白質(zhì)或其功能片段，例如Ku70、Ku80、其組合或者編碼它 們的多核苷酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其中所述的多核苷酸序列處于合適的啟動(dòng)子的控制之下， 并且所述的宿主細(xì)胞還被表達(dá)盒轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)盒包含編碼至少一種目的蛋白質(zhì)的DNA 或RNA序列。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用編碼NHEJ蛋白質(zhì)或其功能片段，例如Ku70、Ku80、 其組合的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其中所述的DNA序列處于合適的啟動(dòng)子的控制之 下，并且所述的宿主細(xì)胞還被表達(dá)盒轉(zhuǎn)染，所述的表達(dá)盒包含編碼至少一種目的蛋白質(zhì)的 DNA序列。
[0016] 此外，還通過(guò)了包含如下序列的質(zhì)粒DNA，其中所述的序列編碼了 NHEJ蛋白質(zhì)或 其功能片段，例如Ku70、Ku80、其組合或其功能片段，其中所述的DNA序列處于合適的啟動(dòng) 子的控制之下。
[0017] 本發(fā)明公開(kāi)進(jìn)一步包含生成如下宿主的方法，所述的宿主能夠表達(dá)由DNA序列編 碼的目的蛋白質(zhì)，所述的方法包含使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟：
[0018] a. Ku70、Ku80、其組合或其功能片段，或者編碼它們的多核苷
[0019] 酸序列，其中所述的多核苷酸序列處于合適的啟動(dòng)子的控制之下；
[0020] 以及
[0021] b.表達(dá)盒，其包含編碼目的蛋白質(zhì)的DNA或RNA序列。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了生成如下宿主細(xì)胞的方法，所述的宿主細(xì)胞能夠表達(dá) 由DNA序列編碼的目的蛋白質(zhì)，所述的方法包含使用以下物質(zhì)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟：
[0023] a?編碼NHEJ蛋白質(zhì)或其功能片段（例如Ku70、Ku80、其組合
[0024] 或其功能片段）的多核苷酸，其中所述的多核苷酸序列處于合適
[0025] 的啟動(dòng)子的控制之下；以及
[0026] b.表達(dá)盒，其包含編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0027] 有利地使用編碼NHEJ蛋白質(zhì)或其功能片段（例如Ku70和/或Ku80)的多核苷酸 似乎增加了所獲得的能夠表達(dá)目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量。這相應(yīng)地增加了識(shí)別用于表達(dá)蛋白 質(zhì)的、合適且穩(wěn)定的細(xì)胞系的可能性。
[0028] 本發(fā)明的方法顯著地減少了分離合適的制造用克隆所需的工作量和來(lái)源，例如 由于使用所述的方法大幅增加了表達(dá)大量蛋白質(zhì)的克隆的數(shù)量，所以可以分析少到25至 75%的克隆。
[0029] 發(fā)明詳述
[0030] 非同源末端連接（NHEJ)是修復(fù)DNA中雙鏈斷裂的途徑。與需要同源序列來(lái)指導(dǎo) 修復(fù)的同源重組相比，由于斷裂末端無(wú)需同源模板而直接連接，所以NHEJ被稱為"非同源 的"。
[0031] NHEJ通常利用被稱為微同源的短同源DNA序列來(lái)指導(dǎo)修復(fù)。這些微同源通常存在 于雙鏈斷裂末端上的單鏈突出末端。
[0032] NHEJ在整個(gè)生命王國(guó)中都是保守的，并且是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的主要的雙鏈修復(fù)途 徑。但是，在芽殖酵母（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中，當(dāng)有機(jī)體在普通的試 驗(yàn)室條件下生長(zhǎng)時(shí)，同源重組占優(yōu)勢(shì)。
[0033] NHEJ蛋白質(zhì)為與NHEJ過(guò)程有關(guān)或者促進(jìn)NHEJ過(guò)程的蛋白質(zhì)。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，NHEJ蛋白質(zhì)以純化形式使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，NHEJ蛋白 質(zhì)包含純化標(biāo)簽，例如His-標(biāo)簽，從而有助于純化過(guò)程。
[0035] 在本文所用的宿主細(xì)胞為在有效轉(zhuǎn)染完成后適用于或者能夠表達(dá)目的蛋白質(zhì)的 細(xì)胞。當(dāng)然，表達(dá)可能需要合適的功能元件，例如啟動(dòng)子等。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為原核生物，例如細(xì)菌，例如大腸桿菌（E.coli)。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞 (例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如 選自中國(guó)倉(cāng)鼠卵（CH0)細(xì)胞，但是可以使用其他的細(xì)胞系，例如由小鼠骨髓瘤（NS0)細(xì)胞、 幼侖鼠腎（BHK)細(xì)胞、人胚腎（HEK-293)細(xì)胞和人視網(wǎng)膜細(xì)胞衍生的那些可以使用。
[0038] 備選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為綠猴腎臟細(xì)胞（vero cell)。
[0039] 非哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包含酵母（例如畢赤酵母屬）或細(xì)菌細(xì)胞系（例如大腸桿菌）。
[0040] 如本文所用，轉(zhuǎn)染是指蓄意將核酸或多肽（例如蛋白質(zhì)）引入細(xì)胞中的過(guò)程?？?以轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)，例如超螺旋質(zhì)粒DNA、線性DNA或siRNA構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 的術(shù)語(yǔ)用于真核細(xì)胞中的非病毒方法。
[0041] 動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染通常涉及在細(xì)胞膜上打開(kāi)瞬時(shí)的孔或"洞"，從而允許物質(zhì)被吸 收?？梢酝ㄟ^(guò)如下來(lái)實(shí)施轉(zhuǎn)染：使用磷酸鈣、通過(guò)電穿孔或通過(guò)將陽(yáng)離子脂質(zhì)與所述的物質(zhì) 混合從而產(chǎn)生脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合并將其負(fù)荷存放在里面。
[0042] Ku70為在人類(lèi)中由XRCC6基因編碼的蛋白質(zhì)。Ku70和Ku80-起構(gòu)成了Ku異二 聚體，該Ku異二聚體與DNA雙鏈斷裂末端結(jié)合，并是DNA修復(fù)的非同源末端連接（NHEJ)途 徑所必需的。此外，還需要其用于V(D)J重組，該重組利用NHEJ途徑以促進(jìn)哺乳動(dòng)物體液 免疫系統(tǒng)中的抗原多樣性。
[0043] 除了在NHEJ中的作用以外，還需要Ku用于端粒長(zhǎng)度的保持和亞端?；虻某聊?。 人類(lèi)蛋白質(zhì)Ku70具有UniProt編號(hào)P12956,鼠蛋白質(zhì)具有編號(hào)P23475。
[0044] 如本文所用，Ku70蛋白質(zhì)的功能片段是指保持了所述蛋白質(zhì)的必需生物學(xué)功能 (特別是NHEJ功能）的蛋白質(zhì)片段。
[0045] Ku80為在人類(lèi)中由XRCC5基因編碼的蛋白質(zhì)。人類(lèi)蛋白質(zhì)具有UniProt編號(hào) P13010,鼠蛋白質(zhì)具有編號(hào)P27641。
[0046]如本文所用，Ku80蛋白質(zhì)的功能片段是指保持了所述蛋白質(zhì)的必需生物學(xué)功能 (特別是NHEJ功能）的蛋白質(zhì)片段。
[0047] 就多核苷酸而言，功能片段是指編碼蛋白質(zhì)的功能片段的多核苷酸，例如本文所 述的。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所用的編碼Ku的多核苷酸或蛋白質(zhì)獨(dú)立地選自倉(cāng)鼠、小鼠、 大鼠、人類(lèi)或