環(huán)孢霉素a免疫原、抗環(huán)孢霉素a特異性抗體和環(huán)孢霉素a檢測(cè)試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及環(huán)孢霉素A免疫原、抗環(huán)孢霉素A特異性抗體和環(huán) 孢霉素A檢測(cè)試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)孢霉素A(CyclosporinA),其結(jié)構(gòu)式如式(III)所示:
[0003]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)抱霉素A免疫原,其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示:
式中,R為連接基團(tuán)
n是1至20之間的整數(shù),優(yōu)選R為
載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多膚,選自血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀 腺球蛋白中的一種,優(yōu)選為血清蛋白,更優(yōu)選為牛血清白蛋白。
2. -種如權(quán)利要求1所述的環(huán)抱霉素A免疫原的制備方法,其特征在于包含W下步 驟: (1) 將載體蛋白100~300g溶解于25~75ml0. 2M,抑8. 5的磯酸緩沖液中; (2) 將如下化學(xué)品加入到小燒杯中攬拌溶解;100~300mg環(huán)抱霉素A衍生物、1. 75~ 5. 25ml二甲基甲酯胺、1. 75~5. 25ml己醇、3. 5~10. 5ml10mM,pH5. 0的磯酸鐘緩沖液、 100~300mg1-己基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、25~75mgN-哲基硫代班巧酷亞胺, 將上述化學(xué)品在室溫下攬拌溶解反應(yīng)30~60min; (3) 將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中,并在2~8°C下攬拌過(guò)夜,得到抗原;將合 成好的抗原經(jīng)過(guò)透析進(jìn)行純化,得到環(huán)抱霉素A免疫原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)抱霉素A免疫原制備方法,其特征在于所述的環(huán)抱霉素A 衍生物結(jié)構(gòu)式如式(II)所示:
上述R為連接基團(tuán)
n為1至20之間的整數(shù),優(yōu)選n= 1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的環(huán)抱霉素A衍生物,其特征在于,合成步驟如下: (1) 稱取0. 08~0. 32mmol環(huán)抱霉素A和0. 08~0. 32mmol化合物A,共同溶解于3~ 6mLDCM中;稱取28~112mg芐基S己基氯化錠,溶解于3~6血40%的KOH水溶液中;將 上述兩種溶液混合成反應(yīng)混合溶液; (2) 將上述反應(yīng)混合溶液在室溫下攬拌過(guò)夜;將反應(yīng)后的溶液用肥1調(diào)節(jié)抑值至抑= 5.0~7.0,然后將有機(jī)層分離; (3) 將有機(jī)相濃縮,然后用制備博層色譜法進(jìn)行純化,得到4. 5~18mg白色固體狀的最 終產(chǎn)物,產(chǎn)率50% ; (4) 利用核磁共振技術(shù)和色譜/質(zhì)譜技術(shù)對(duì)得到的最終產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定,可W確定 該最終所得化合物為上述式(II)所示的環(huán)抱霉素A衍生物; 所述化合物A選自2-(漠甲基)丙締酸甲醋、4-漠-2-亞甲基了酸甲醋、5-漠-2-亞 甲基戊酸甲醋、6-漠-2-亞甲基己酸甲醋或其它類似物中的任意一種,優(yōu)選為2-(漠甲基) 丙締酸甲醋。
5. -種抗環(huán)抱霉素A特異性抗體,由權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的環(huán)抱霉素A免疫原 免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后產(chǎn)生的完整抗體分子,或者為保留與環(huán)抱霉素A特異性結(jié)合能力的抗體片 段或抗體衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗環(huán)抱霉素A特異性抗體,其特征在于所述的完整的 抗體分子、抗體片段或抗體衍生物,為采用單一的環(huán)抱霉素A免疫原對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫所獲 得的多克隆抗體,或者為免疫后經(jīng)體細(xì)胞雜交獲得的單克隆抗體;所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為兔、山 羊、小鼠、綿羊、豚鼠或馬的一種,優(yōu)選為兔。
7. -種如權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的抗環(huán)抱霉素A特異性抗體的制備方法,其特征 在于包含W下步驟: (1) 用PBS將牛血清白蛋白-環(huán)抱霉素A免疫原稀釋至1.Omg/ml,得到抗原溶液,然后 用1. 0ml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行注射; (2) 2~3周后,再用1. 0ml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射一 次,之后每隔四周注射一次,共計(jì)注射4次; (3)對(duì)步驟(2)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血,分離純化得到效價(jià)為1:30000-1:50000的抗環(huán)抱霉素A特異性抗體。
8. -種環(huán)抱霉素A檢測(cè)試劑,含有權(quán)利要求5-7所述的抗環(huán)抱霉素A特異性抗體和指 示試劑,所述的指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、巧光試劑或發(fā)光試劑中的一種, 優(yōu)選為酶試劑;所述的酶試劑由環(huán)抱霉素A酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物組成,酶標(biāo)偶聯(lián)物優(yōu)選 為葡萄糖-6-磯酸脫氨酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物,酶的底物優(yōu)選為葡萄糖-6-磯酸。
9. 一種如權(quán)利要求8所述的環(huán)抱霉素A檢測(cè)試劑的制備方法,其特征在于包含W下步 驟: (1)試劑A;將2. 018~8. 072g、5. 625~22. 50mM氧化態(tài)的煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸和 0. 856 ~3. 422g、5. 625 ~22. 50mM葡萄糖-6-磯酸用 0. 5 ~化 55mM、pH= 8. 0 的Tris緩 沖液溶解制成均相酶底物;將權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的抗環(huán)抱霉素A特異性抗體加到 上述均相酶底物中,抗環(huán)抱霉素A特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100~1:10000 ; 似試劑B;將環(huán)抱霉素A酶標(biāo)偶聯(lián)物加到120mM、pH= 8. 2的Tris緩沖液中,環(huán)抱霉 素A酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000 ; 所述的抗環(huán)抱霉素A特異性抗體與均相酶底物的體積比優(yōu)選為1:400 ; 所述的環(huán)抱霉素A酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比優(yōu)選為1:1500。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的環(huán)抱霉素A檢測(cè)試劑,其特征在于所述的環(huán)抱霉素 A酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備方法包含W下步驟: (1) 葡萄糖-6-磯酸脫氨酶溶液的制備;稱取7. 5~22. 5mg規(guī)格為100KU的葡萄 糖-6-磯酸脫氨酶,室溫溶解于6~18血含有72. 6mg0. 05MTris、8mg3. 3mMMgCl2和 lOOmg化Cl的溶液中,抑=9. 0 ;在溶液中加入112. 5~337. 5mg還原態(tài)的煙酷胺腺嚷嶺 二核巧酸、67. 5~202. 5mg葡萄糖-6-磯酸W及0. 375~1. 125血卡必醇;再逐滴加入1~ 3血二甲基亞諷; (2) 環(huán)抱霉素A衍生物的激活:在無(wú)水狀態(tài)下稱取5~15mg環(huán)抱霉素A衍生物,溶解 于300~900yL二甲基甲酯胺中;使上述溶液溫度降到-2~-8°C;加入1. 5~4. 5yLS 了胺;加入0. 75~2. 25化氯甲酸異了醋;-2~-8°C攬拌30~60分鐘; (3) 葡萄糖-6-磯酸脫氨酶與環(huán)抱霉素A衍生物的連接;將步驟(2)激活的環(huán)抱霉素A 衍生物溶液逐滴加入到步驟(1)溶解的葡萄糖-6-磯酸脫氨酶溶液中;2-8°C攬拌過(guò)夜; (4) 純化產(chǎn)物;通過(guò)G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物,獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磯 酸脫氨酶-半抗原偶聯(lián)物,于2-8 °C下儲(chǔ)存。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)孢霉素A免疫原及其合成方法,以及由該免疫原獲得的抗環(huán)孢霉素A抗體、檢測(cè)試劑及其制備方法。本發(fā)明制備的環(huán)孢霉素A免疫原,免疫原性高,可以誘導(dǎo)得到高效價(jià)的抗環(huán)孢霉素A特異性抗體,并且與常見的62種藥物無(wú)任何交叉反應(yīng);由該抗體制備得到的環(huán)孢霉素A檢測(cè)試劑,可以精確快速地確定樣品中的環(huán)孢霉素A含量。與市場(chǎng)上現(xiàn)有的檢測(cè)試劑比較,本發(fā)明檢測(cè)試劑具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),還能有效降低環(huán)孢霉素A檢測(cè)成本,有利于臨床大規(guī)模推廣使用。
【IPC分類】C07K14-795, G01N33-577, C07K14-47, C07K14-765, C07K16-44
【公開號(hào)】CN104788560
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510250240
【發(fā)明人】虞留明, 邱玲, 婁金麗, 毛遠(yuǎn)麗
【申請(qǐng)人】蘇州博源醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月16日