一株雞源屎腸球菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物菌種選育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株雞源屎腸球菌菌株及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥發(fā)酵技術(shù)是指利用自然界所存在的微生物強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化能力，對(duì)藥材進(jìn)行 活性成分轉(zhuǎn)化、毒性成分降低以及有效成分的提取與分離。微生物發(fā)酵中藥主要具有以下 特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：反應(yīng)溫和，保護(hù)活性；提高藥效，減少毒副；修飾結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)新藥；穩(wěn)定質(zhì)量，利 于現(xiàn)代；菌種豐富，方向可控；節(jié)約藥源，增加效益。優(yōu)良的微生物菌種是中藥發(fā)酵技術(shù)的 基礎(chǔ)和關(guān)鍵，要使發(fā)酵中藥及中藥有效成份產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，首先必 須選育性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。
[0003] 屎腸球菌（ihterococctts/'aciwfl?)屬腸球菌屬，是人及動(dòng)物腸道中正常菌群的重要 組成部分，在促進(jìn)腸道健康（調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和防治腹瀉）和提高生長(zhǎng)性能方面有顯著 功能，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部2003年公布的《飼料添加劑品種目錄》中允許使用的益生菌種。該菌相 對(duì)于嚴(yán)格厭氧、培養(yǎng)和保存條件都苛刻的雙歧桿菌、乳桿菌來(lái)說(shuō)，更有利于生產(chǎn)和使用。經(jīng) 研宄證明，屎腸球菌及其代謝產(chǎn)物可用于獸藥和飼料，具有提高促生長(zhǎng)、抑制病原菌和腐敗 菌、提高免疫力、降低幼畜腹瀉率等生理功效。有關(guān)利用屎腸球菌進(jìn)行中藥，特別是黨參、黃 芪的發(fā)酵，目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本申請(qǐng)人從雞腸道混合菌（C8GF20)中分離出 了一株厚壁菌門(mén)，桿菌綱，乳桿菌目，腸球菌科，腸球菌屬的屎腸球菌，并利用物理、化學(xué)誘 變的方法，選育出可用于發(fā)酵中藥，特別是發(fā)酵黃芪和黨參轉(zhuǎn)化多糖性能好的菌株，將其命 名為屎腸球菌腫）C8GF20-06,并送至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄 所，保藏時(shí)間2013年11月15日，保藏號(hào)CGMCC No. 8476。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述菌株在發(fā)酵黃芪和黨參中的應(yīng)用。
[0006] 優(yōu)選地，所述在發(fā)酵黨參中的應(yīng)用為：在黨參發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3%~5%屎腸球 菌CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6.4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵 48h ;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黨參；其中，所述黨參發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：玉米粉 25. 79 g ;氮源 0. 6g ;胡蘿卜粉 2. 28 g ;牛肉浸膏 1. 56 g ;無(wú)機(jī)鹽K2HP04-KH2P04 2. 18g ;黨 參 120-150g ;1000mL 蒸餾水。
[0007] 優(yōu)選地，所述在發(fā)酵黃芪中的應(yīng)用為：在黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3%屎腸球菌 CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37 °C，初始pH為6. 4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵 48h ;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黃芪；其中，所述黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：乳清粉 5. 158g ;蛋白胨 0. 456g ;葡萄糖 0. 12g ;酵母粉 0. 312g ;無(wú)機(jī)鹽 K2HP04-KH2P04 0. 194g ;黃芪 16g ;200mL 蒸餾水。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供發(fā)酵黃芪的制備方法，在黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3%屎腸球菌CGMCCNo.8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6.4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/ min發(fā)酵48h;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黃芪；其中，所述黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基的配方 為：乳清粉5. 158g;蛋白胨0. 456g;葡萄糖0. 12g;酵母粉0. 312g;無(wú)機(jī)鹽K2HP04-KH2P04 0? 194g;黃苗16g;200mL蒸餾水。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供發(fā)酵黨參的制備方法，在黨參發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 3%~5%屎腸球菌CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6.4~7. 4的厭氧環(huán) 境下，120r/min發(fā)酵48h ;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黨參；其中，所述黨參發(fā)酵培 養(yǎng)基的配方為：玉米粉25.79 g;氮源0.6g;胡蘿卜粉2.28 g;牛肉浸膏1.56 g;無(wú)機(jī)鹽 K2HP04-KH2P04 2. 18g ;黨參 120-150g ;1000mL 蒸餾水。
[0010] 本發(fā)明將C8GF20的菌懸液各以1%的接種量接種于含12. 5%黨參的乳桿菌選擇性 培養(yǎng)基MRS中厭氧培養(yǎng)并傳代純化，獲得了 1株長(zhǎng)勢(shì)好的菌株C8GF20-01，并對(duì)其進(jìn)行紫 外-亞硝基胍復(fù)合誘變后選育出的1株可發(fā)酵黃芪和黨參轉(zhuǎn)化多糖性能好的菌株屎腸球菌 C8GF20-06(菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 8476)。利用分子生物學(xué)鑒定法、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及生 化反應(yīng)鑒定法，確定C8GF20-06為厚壁菌門(mén)，桿菌綱，乳桿菌目，腸球菌科，腸球菌屬。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為屎腸球菌C8GF20-06菌株的革蘭氏染色顯微鏡圖（X 1000); 圖2為屎腸球菌C8GF20-06菌株的16S rDNA擴(kuò)增電泳圖；泳道1、2分別為C8GF20-01、 C8GF20-06菌株基因組。左圖為DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0013] 實(shí)施例1 屎腸球菌C8GF20-06 菌株 CGMCC No. 8476 的獲得： 1、屎腸球菌C8GF20混合菌種的分離和純化 在前期研宄中，發(fā)明人所在課題組從健康、未使用過(guò)抗生素的健康土雞盲腸中分離出 混合菌C8GF20,并已于以下方式公開(kāi)：1、張凱，楊志強(qiáng)等，雞腸內(nèi)菌發(fā)酵黨參轉(zhuǎn)化多糖實(shí)驗(yàn) 研宄，中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008年；2、李建喜，中獸藥生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研宄--益生菌發(fā)酵對(duì)黃 芪黨參多糖提取影響，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，博士論文，2012。上述人員保證自申請(qǐng)日起二十年 內(nèi)向公眾提供分離得到的混合菌C8GF20。
[0014] 取C8GF20的菌懸液以1%的接種量接種于含12. 5%黨參藥液的選擇性培養(yǎng)基MRS， 37°C厭氧培養(yǎng)24h為第一代。勾出生長(zhǎng)良好的單一菌落，同一培養(yǎng)條件連續(xù)劃線厭氧傳代 6次后，獲得了 1株長(zhǎng)勢(shì)好的單個(gè)菌落C8GF20-01。
[0015] 2、C8GF20-01的誘變與篩選 采用亞硝基胍誘變法對(duì)上述篩選的菌株C8GF20-01進(jìn)行誘變，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵型黨參多 糖的轉(zhuǎn)化率篩選得到優(yōu)良的高產(chǎn)菌株C8GF20-06,可用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)黨參多糖的生產(chǎn)。具體 操作方法如下： (1)選用l.Omg/ mL的NTG加至C8GF20-01的菌懸液中，分別在37°C水浴中處理0、10、 15、20、25、30、35min，用PBS洗滌3次除去NTG殘留，振蕩懸浮菌體沉淀，用無(wú)菌生理鹽水梯 度稀釋后涂布MRS平板培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)72 h。
[0016] (2)選擇在MRS平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率快、形態(tài)飽滿的單菌落，接入MRS肉湯， 120r/min、37°C厭氧搖床培養(yǎng)；傳3代后，按體積分?jǐn)?shù)3 %的接菌量接入100mL黨參發(fā)酵培 養(yǎng)基(黨參發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉25.79 g;氮源0.6g;胡蘿卜粉2.28 g;牛肉浸膏 1. 56 g ;無(wú)機(jī)鹽K2HP04-KH2P04 2. 18g ;黨參 120-150g ;1000mL 蒸餾水)，置于 37°C，初始 pH為 6. 4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵48h。
[0017] 發(fā)酵結(jié)束后，4000r/min離心10min進(jìn)行固液分離，上清轉(zhuǎn)入另一潔凈器皿保存； 沉淀加入100mL的蒸餾水煮沸1. 5h，冷卻到室溫后，離心取上清?；旌蟽纱蔚纳锨?，沸水浴 中濃縮至35mL，加入3倍體積的95%乙醇，邊加邊攪拌，4°C靜置24h，收集沉淀；將醇沉過(guò)夜 后的上清，再4000r/min離心10min，將兩次沉淀混合，回收乙醇。沉淀干燥后用100mL蒸 餾水溶解，再稀釋400倍，取2. OmL稀釋好的粗多糖溶液置于具塞試管中，采用苯酚硫酸法 測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量。由表1可知，正突變株為用l.〇mg/ml NTG作用30min得到的， 將其命名為菌株C8GF20-06,該菌株較原菌發(fā)酵黨參時(shí)多糖含量增加了 21. 37%。
[0018] 表1 NTG誘變C8GF20-01正突變株篩選
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株雞源屎腸球菌（Aflterococcys/acitt?)C8GF20-06菌株，其特征在于：所述菌株 的保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8476。
2. 權(quán)利要求1所述的菌株在發(fā)酵黃芪和黨參中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述在發(fā)酵黨參中的應(yīng)用為：在黨參發(fā) 酵培養(yǎng)基中加入3%~5%屎腸球菌CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6. 4~ 7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵48h ;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黨參；其中，所述 黨參發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：玉米粉25. 79 g ;氮源0. 6g ;胡蘿卜粉2. 28 g ;牛肉浸膏1. 56 g ;無(wú)機(jī)鹽 K2HPO4-KH2PO4 2. 18g ;黨參 120-150g ; 1000 mL 蒸餾水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述在發(fā)酵黃芪中的應(yīng)用為：在黃芪發(fā)酵 培養(yǎng)基中加入3%屎腸球菌CGMCCNo. 8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6. 4~7. 4的 厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵48h;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黃芪；其中，所述黃芪發(fā) 酵培養(yǎng)基的配方為：乳清粉5. 158g;蛋白胨0. 456g;葡萄糖0. 12g;酵母粉0. 312g;無(wú)機(jī)鹽 K2HPO4-KH2PO4 0? 194g;黃芪 16g;200mL蒸餾水。
5. 發(fā)酵黃芪的制備方法，其特征在于：在黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3%屎腸球菌CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37°C，初始pH為6. 4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵48h ;取發(fā) 酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黃芪；其中，所述黃芪發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：乳清粉5. 158g ; 蛋白胨 0.456g;葡萄糖 0. 12g;酵母粉 0.312g;無(wú)機(jī)鹽 K2HPO4-KH2PO4 0. 194g;黃芪 16g; 200mL蒸餾水。
6. 發(fā)酵黨參的制備方法，其特征在于：在黨參發(fā)酵培養(yǎng)基中加入3%~5%屎腸球菌 CGMCC No. 8476細(xì)菌懸液，置于37 °C，初始pH為6. 4~7. 4的厭氧環(huán)境下，120r/min發(fā)酵 48h ;取發(fā)酵液真空冷凍干燥，即得發(fā)酵黨參；其中所述黨參發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：玉米粉 25. 79 g ;氮源 0. 6g ;胡蘿卜粉 2. 28 g ;牛肉浸膏 1. 56 g ;無(wú)機(jī)鹽K2HPO4-KH2PO4 2. 18g ;黨 參 120-150g ;1000mL 蒸餾水。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株雞源屎腸球菌（Enterococcus facium）C8GF20-06菌株，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.8476。本發(fā)明從C8GF20菌株出發(fā)，選育出1株雞源屎腸球菌CGMCC No.8476，該菌株是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，屬于腸球菌屬，具有轉(zhuǎn)化多糖能力高的特點(diǎn)，可用于中藥如黨參、黃芪等的發(fā)酵，具有提高藥物中有效成分和活性物質(zhì)的提取率，增強(qiáng)功效，減少中藥資源的浪費(fèi)等優(yōu)點(diǎn)。CGMCC No.847620131115
【IPC分類】A61K36-481, C12R1-01, C12N1-20, A61K36-344
【公開(kāi)號(hào)】CN104789498
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510156610
【發(fā)明人】李建喜, 張景艷, 楊志強(qiáng), 王學(xué)智, 張凱, 秦哲, 王旭榮, 王磊, 孔曉軍, 孟嘉仁
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日