一株具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌ab-2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株分離自四川泡菜中的植物乳桿菌菌株（Lactobaci 1 lus plantarum AB-2)和以該菌株為發(fā)酵劑或添加劑的發(fā)酵乳制品及其它健康保健食品中的應(yīng) 用。 技術(shù)背景
[0002] 隨著公眾衛(wèi)生和安全意識的提升，食品安全問題被越來越多的公眾所重視，因食 品安全問題可能會導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害人體健康和社會治安。這其中食品微生 物污染問題是食品安全的主要問題之一。食品微生物的污染主要是細(xì)菌污染，特別是常見 致病性的單細(xì)胞李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌等細(xì)菌均能引起 食源性疾病，現(xiàn)在這一問題已經(jīng)引起了公眾的注意，普通的化學(xué)藥物治療方法又易使致病 菌產(chǎn)生抗藥性、藥物殘留和治療效果不佳等缺陷。乳酸菌被用于多種發(fā)酵食品加工，已被人 類食用上千年，最近的研宄表明乳酸菌能有效的抑制致病菌的生長，又因其具有穩(wěn)定性、免 疫性和安全性等優(yōu)勢，被認(rèn)為是新型食品防腐劑和保健食品研宄的重要方向。
[0003] 乳酸菌對一些腸道致病菌有較好的抑制作用。這些抑制作用可能是由于產(chǎn)生酸性 物質(zhì)使不耐酸致病菌生長繁殖受到抑制；產(chǎn)生類似細(xì)菌素的小分子肽類使致病菌受到抑制 作用；產(chǎn)生溶菌酶、過氧化氫等物質(zhì)殺死潛在的病原菌。乳酸菌可維持人體中基本的營養(yǎng) 物質(zhì)，清除食物中的毒性物質(zhì)，根除發(fā)酵食物中的病原體，清除腸道微生物產(chǎn)生的毒素和廢 物，形成生物學(xué)屏障。然而，乳酸菌想要應(yīng)用于具有抑菌功能的保健品生產(chǎn)，還需要對其抑 菌物質(zhì)的穩(wěn)定性和益生特性進(jìn)行評價，其中穩(wěn)定性包括在不同的PH、排除不穩(wěn)定的抑菌物 質(zhì)過氧化氫和對蛋白酶的穩(wěn)定性，而益生特性則是要檢測其在人體內(nèi)應(yīng)用的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種新型乳桿菌菌株，其具有優(yōu)異的作為益生菌基本 性質(zhì)的耐酸性、耐膽汁酸性、過氧化氫酶的穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌用于預(yù)防和治療腸道疾病的組合物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌廣譜抑菌活性的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌在食品防腐劑和保健食品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌在農(nóng)業(yè)生物農(nóng)藥和果蔬保鮮劑方面的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌在整腸中的應(yīng)用，具有良好的益生特性。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供新型乳桿菌以作為發(fā)酵劑或添加劑在發(fā)酵乳制品及其 他健康保健食品中的應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株植物乳桿菌的新菌株（L. plantarum AB-2)及 其制備方法。該菌株（L. plantarum AB-2)已于2014年9月15日在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 9654。
[0012] 本發(fā)明的植物乳桿菌（L.plantarumAB-2)是經(jīng)過篩選的、從四川泡菜中分離得到 的具有廣譜抑菌活性的植物乳桿菌。
[0013] 本發(fā)明的植物乳桿菌（L. plantarum AB-2)是通過如下方法分離得到。
[0014] a.菌株分離方法：
[0015] 先將從四川采集的泡菜進(jìn)行前處理，再做梯度稀釋后（1(T4,1(T5, KT6)涂布于含有 放線菌酮（0. lwt %，0XID公司）和硫酸粘菌素（0. lwt %，0XID公司）的MRS瓊脂培養(yǎng)基或 者M(jìn)17瓊脂培養(yǎng)基（0XID公司）上，30°C厭氧培養(yǎng)48h~72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于TPY增菌 培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h~48h，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基（0XID)，30°C培養(yǎng)24h~48h， 觀察記錄菌落形態(tài)和革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征，并同時進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)。將革蘭氏染 色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌，暫定為乳酸菌。將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C 培養(yǎng)24h~48h后，做進(jìn)一步鑒定和保存。
[0016] b?分子生物學(xué)鑒定：
[0017] 本發(fā)明的植物乳桿菌（L. plantarum AB-2)是通過如下方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定 的。將冷凍保存的供試菌株接種于TPY液體培養(yǎng)基中，30 °C恒溫培養(yǎng)24h，經(jīng)TPY傳代培 養(yǎng)2~3代后，取2mL對數(shù)生長末期的菌體培養(yǎng)物置于無菌EP管內(nèi)離心，經(jīng)8000 X g離心 3min(4°C )后收集菌體，棄上清，采用乳酸菌專用CTAB凍融法提取菌株的基因組DNA。
[0018] 采用通用引物，正向引物是27f (對應(yīng)于Escherichia coil 8-27位堿基）： 5 ' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是 1495r(對應(yīng)于 Escherichia coil 1495-1515 位堿基）：5 ' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 '，以菌體 DNA 為擴(kuò)增模板 PCR 擴(kuò)增 16S rRNA基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行16S rRNA基因序列測定，然后通過基因序列比 對和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研宄進(jìn)行種屬鑒定。所得菌株顯示出了與植物乳桿菌最高的分子系統(tǒng)學(xué) 上的親緣關(guān)系。將上述微生物鑒定為植物乳桿菌，命名為L. plantarum AB-2。植物乳桿菌 L. plantarum AB-2的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖見圖3〇
[0019] c?形態(tài)學(xué)特性：
[0020] 本發(fā)明的植物乳桿菌L. plantarum AB-2具有如下形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞呈直桿狀，有 圓形末端，長3. 0-8. 0 y m，寬0? 9-1. 2 y m，呈單個、成對，或短鏈狀出現(xiàn)（見圖1)，有些菌能 減少硝酸鹽，偶爾有些菌株表現(xiàn)出擬過氧化氫酶活性。
[0021] d.菌落形態(tài)特性：
[0022] 本發(fā)明的植物乳桿菌L. plantarum AB-2在MRS瓊脂培養(yǎng)基上生長形成乳白色菌 落，不透明，圓形，表面光滑，中央凸起，直徑約為1.2-1. 5mm(見圖2)。
[0023] 植物乳桿菌（L. plantarum) AB-2抑菌性能測定
[0024] e.植物乳桿菌MRS發(fā)酵上清的制備方法
[0025] 以廣泛采集的347株植物乳桿菌作為篩選具有抑制致病菌活性植物乳桿菌的來 源并進(jìn)行對比，該347株植物乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與工程"教育部重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室提供，它們分別分離自內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、甘肅、云南、四川以及蒙古國地區(qū)的 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中。把凍存管中的保藏液接種到5mL的MRS液體培養(yǎng)基中，震蕩混勻，37°C恒 溫培養(yǎng)24h，以2%的接種量連續(xù)活化三代，取第三代的發(fā)酵液以4000Xg離心10min，取上 清，上清液經(jīng)0. 22 y m微膜過濾，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0026] f.指示菌濃度的確定：
[0027] 將活化好的5株指示菌（單細(xì)胞李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7、 傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌）按2% (V/V)接入各自培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵24h，使菌體充分 富集，以MRS為培養(yǎng)基用平板計數(shù)法計數(shù)。得到計數(shù)結(jié)果后，將腸道致病菌菌液制成104、 105、10 6、107的指示菌細(xì)胞懸液，以乳酸調(diào)節(jié)pH為4. 0的MRS無細(xì)胞懸液為標(biāo)準(zhǔn)，利用打孔 瓊脂擴(kuò)散法，確定抑菌圈最易觀測的腸道致病菌的生長量作為指示菌懸液的最佳濃度，最 終確定1〇 6為最佳觀測濃度，指示菌菌落生長情況見表1。
[0028] 表1不同濃度指示菌的抑菌效果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_2,已于2014 年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號 為CGMCCNo. 9654。
2. 含有權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_2的組合物。
3. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_2在抑制致病菌中的 應(yīng)用，所述細(xì)菌為： (1) 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌或單細(xì)胞李斯特氏菌； 或者 (2) 甜瓜疫霉菌。
4. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在食品防腐劑中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在農(nóng)業(yè)生物農(nóng)藥或果蔬保鮮劑中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌作為發(fā)酵劑或食品添加劑在保健食品中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述保健食品是發(fā)酵食品。
8. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在制備預(yù)防或治療腸道疾病的藥物中的用途。
9. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在動物飼料中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有廣譜抑菌特性的植物乳桿菌，該菌被命名為Lactobacillus plantarum AB-2，已于2014年09月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No.9654。本發(fā)明的植物乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的廣譜抑菌特性，且該菌株有較好益生特性，其MRS發(fā)酵上清液經(jīng)不同pH、過氧化氫酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后依然能表現(xiàn)出較好的廣譜抑菌特性，最終證明其有較好的廣譜抑菌特性和在人體腸道存活能力。CGMCC No.965420140915
【IPC分類】C12N1-20, A23L3-3571, A61K35-747, C12R1-25, A61P31-04, A23L1-30, A61P31-10, A23K1-16
【公開號】CN104789511
【申請?zhí)枴緾N201510230679
【發(fā)明人】陳永福, 張和平, 李常坤
【申請人】內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月8日