異戊二烯的生產(chǎn)菌以及生產(chǎn)異戊二烯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本文涉及異戊二烯的生產(chǎn)菌以及利用異戊二烯生產(chǎn)菌生產(chǎn)異戊二烯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異戊二烯，即2-甲基-1，3- 丁二烯，是一種帶有共軛雙鍵的活潑烯烴（圖1)。異 戊二烯不溶于水，但可與一般有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚、丙酮和苯等互溶。異戊二烯在l〇〇kPa 下沸點(diǎn)僅為34°C，所以極易揮發(fā)。它還容易發(fā)生自身聚合，也易與別的不飽和化合物共 聚。在齊格勒-納塔催化劑的作用下聚合，則會(huì)產(chǎn)生聚異戊二烯，即天然橡膠（http:// en.wikipedia. org/wiki/Isoprene)〇
[0003] 由于自然條件的限制，我國(guó)的天然橡膠資源一直處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，進(jìn)口依賴 度持續(xù)高于七成，進(jìn)口地區(qū)集中于三大產(chǎn)膠國(guó)泰國(guó)、印尼和馬來(lái)西亞，天然橡膠原料短缺已 成為制約我國(guó)橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。2010年我國(guó)天然橡膠總產(chǎn)量為68萬(wàn)噸，而進(jìn)口量則高 達(dá)186萬(wàn)噸，天然橡膠的自給率僅為27%。而異戊橡膠因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)和性能和天然橡膠的相 似性，成為了面對(duì)當(dāng)今國(guó)內(nèi)天然橡膠資源短缺狀態(tài)的最佳替代品。若以15%的異戊橡膠替 代進(jìn)口天然橡膠，則可以估算出2010年國(guó)內(nèi)異戊橡膠的理論需求量超過27萬(wàn)噸?？梢娢?國(guó)異戊橡膠的發(fā)展空間巨大（王啟飛，于洋，張紅兵，葉強(qiáng).我國(guó)發(fā)展異戊二烯橡膠前景分 析[J].中外能源，2011，16(8) :68-71)，由此帶動(dòng)的對(duì)異戊橡膠單體異戊二烯的需求也將 十分可觀。世界上異戊橡膠的主要生產(chǎn)國(guó)為俄羅斯、日本、美國(guó)。但是遺憾的是，中國(guó)直到 2010年4月才建立了 1. 5萬(wàn)噸/年的生產(chǎn)裝置，是七大合成膠中中國(guó)量產(chǎn)最晚的品種。制 約我國(guó)異戊橡膠產(chǎn)業(yè)的主要因素在于其聚合單體--異戊二烯資源集中困難，難以達(dá)到產(chǎn) 業(yè)化規(guī)模。
[0004] 目前異戊二烯的生產(chǎn)方法主要有石油分離法和化學(xué)合成工藝（Nicolaou, K. C. et al.Total synthesis of eleutherobin.Angew. Chem. Int. Ed. 36, 2520 - 2524(1997).; 和 Avery, M. A. , Chong, W. K. M. &Jennings_White，C. Stereoselective total synthesis of (+)-artemisinin, the antimalarial constituent of Artemisia annua L. J. Amer. Chem. Soc. 114, 974 - 979 (1992))，以及近年來(lái)新興起的生物合成法。其中主要有如下幾種 方法：
[0005] (1)分離生產(chǎn)異戊二烯
[0006] 分離工藝主要是將裂解碳五餾分中的異戊二烯采用萃取精餾技術(shù)分離出來(lái)，裂解 碳五餾分是石腦油及其它重質(zhì)裂解原料蒸汽裂解制乙烯過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其異戊二 烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%~25%。分離工藝中的二甲基甲酰胺法（DMF法）、乙腈法（ACN法）、 N-甲基吡咯烷酮法（NMP法）均已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們進(jìn)行了化學(xué) 吸附法和膜分離等方法生產(chǎn)異戊二烯的探討。下面的表1列出了各種分離方法的原理與特 點(diǎn)。
[0007] 表1各分離方法原理與特點(diǎn)列表
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于以甲醇為原料生產(chǎn)異戊二烯的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于甲基桿菌屬 (Methylobacterium)，并且所述細(xì)菌經(jīng)過修飾表達(dá)異戊二烯合成酶（IspS)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)進(jìn)一步修飾還表達(dá)異戊二烯基二磷酸 異構(gòu)酶（IDI)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)進(jìn)一步修飾還表達(dá)： HMG-CoA合成酶（HMGS)、 HMG-CoA還原酶（HMGR)、 甲羥戊酸激酶（MK)、 二氧磷酸甲羥戊酸激酶（PMK)、以及 甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MPD)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述異戊二烯合成酶（IspS)的氨基 酸序列為SEQIDNO: 1所示的序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌，其中所述異戊二烯基二磷酸異構(gòu)酶（IDI)的氨基酸序 列為SEQIDN0:2所示的序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中所述HMG-CoA合成酶（HMGS)的氨基酸序列為SEQ IDNO:3所示的序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中所述HMG-CoA還原酶（HMGR)的氨基酸序列為SEQ IDNO:4所示的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中所述甲羥戊酸激酶（MK)的氨基酸序列為SEQID NO:5所示的序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中所述二氧磷酸甲羥戊酸激酶（PMK)的氨基酸序列 為如SEQIDNo:6所示的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中所述甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MPD)的氨基酸序列 為如SEQIDNo:7所示的序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有絲氨酸循環(huán)途徑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有MEP途徑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其中該細(xì)菌具有乙酰乙酰CoA硫解酶（phaA酶）。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自扭脫甲基 桿菌（Methylobacteriumextorquens)或羅得西亞甲基桿菌（Methylobacterium rhodesianum)〇
15. -種編碼異戊二烯合成酶（IspS)的DNA序列，其序列為SEQIDN0:8。
16. -種編碼甲羥戊酸激酶（MK)的DNA序列，其序列為SEQIDNO: 9。
17. -種編碼二氧磷酸甲羥戊酸激酶（PMK)的DNA序列，其序列為SEQIDNO: 10。
18. -種編碼甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MPD)的DNA序列，其序列為SEQIDNO: 11。
19. 用于生產(chǎn)異戊二烯的方法，其包括： 以甲醇為碳源培養(yǎng)權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌，產(chǎn)生異戊二烯。
【專利摘要】本文涉及一種異戊二烯的生產(chǎn)菌以及生產(chǎn)異戊二烯的方法。具體來(lái)說(shuō)涉及一種以甲醇為原料生產(chǎn)異戊二烯的屬于甲基桿菌屬(Methylobacterium)的細(xì)菌，對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行修飾使其表達(dá)異戊二烯合成酶(IspS)。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-54, C12N15-60, C12P5-02, C12R1-26
【公開號(hào)】CN104789512
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410020537
【發(fā)明人】張翀, 朱文亮, 邢新會(huì), 梁偉凡
【申請(qǐng)人】清華大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2014年1月16日