骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種骨質(zhì)疏松大鼠長骨原代成骨細(xì)胞分離方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種多原因誘發(fā)，以骨量的減少和骨組織微量結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性疾病。根據(jù)WHO (世界衛(wèi)生組織)統(tǒng)計(jì)，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率已躍升到眾多常見疾病和多發(fā)病的第7位?，F(xiàn)在全球每3名婦女和每8名男性中分別有I人患骨質(zhì)疏松癥。在美國，約有1000萬人罹患骨質(zhì)疏松，另有1.4-1.8萬人患有骨質(zhì)減少；在中國，目前骨質(zhì)疏松癥患者已達(dá)6300萬。骨質(zhì)疏松癥主要出現(xiàn)在絕經(jīng)后的女性和老年男性中。
[0003]骨質(zhì)疏松會(huì)引起一系列的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著人們的日常生活自理能力。骨折是骨質(zhì)疏松最為常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥。骨質(zhì)疏松患者骨與正常骨相比密度低、強(qiáng)度低、骨脆性大，骨折的風(fēng)險(xiǎn)非常高。在美國，每年因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折約有150萬人，不同程度的有椎體骨折、髖部骨折、橈骨遠(yuǎn)端骨折，約有25%的人死于骨折相關(guān)的并發(fā)癥；在歐洲，50歲以上的人群中有1/8的人因骨質(zhì)疏松患過脊椎骨折，80歲人群中1/3婦女及1/9的男性因骨質(zhì)疏松患過髖骨骨折。骨質(zhì)疏松性骨折存在著終生危險(xiǎn)性，據(jù)報(bào)道，在美國罹患髖骨骨折的婦女中約有60%的人不能回復(fù)到骨折前的功能狀態(tài)，出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)受限甚至是終生活動(dòng)受限。在老年人中，隨著年齡增長，骨質(zhì)疏松概率越高，且與其骨折發(fā)病率呈正相關(guān)性。隨著全球老齡化加劇，骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折及其并發(fā)癥逐漸成為不容忽視的醫(yī)療問題。
[0004]骨質(zhì)疏松骨折補(bǔ)位骨量低，且多為粉碎性骨折，所以外科治療常使用材料植入和抗骨質(zhì)疏松藥物的共同療法。目前使用的植入材料包括鈦、鈷合金，羥基磷灰石陶瓷材料等；抗骨質(zhì)疏松藥物主要包括雌激素、磷酸鹽類及甲狀旁腺素等。每年度約有近百種新材料及抗骨質(zhì)疏松藥物問世。目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛地使用大鼠模型來模擬骨質(zhì)疏松病癥，進(jìn)行新材料及藥物檢測和評估。但以動(dòng)物活體作為篩選模型存在著成本高，周期長，細(xì)胞學(xué)機(jī)理不明等傳統(tǒng)缺陷。該領(lǐng)域內(nèi)缺乏一種高效而專一的體外成骨細(xì)胞病理模型。
[0005]現(xiàn)有的成骨細(xì)胞的一般培養(yǎng)方法分為酶消化法和組織塊法，主要針對動(dòng)物胚胎或幼體的顱骨進(jìn)行膠原酶(Collagenase)消化(孵育時(shí)間通常為40分鐘以上)配合物理分離，得到一定量的成骨細(xì)胞。然而膠原酶消化對于成骨細(xì)胞及其膜上的功能蛋白可能存在著不可逆的損傷及改變，消化時(shí)間難以掌握，在病理細(xì)胞的體外分離中應(yīng)盡量避免。另外，動(dòng)物胚胎或幼體的骨組織尚未礦化，且富含多種除成骨細(xì)胞之外的細(xì)胞，如:軟骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等，原代培養(yǎng)中難以得到較純的成骨細(xì)胞。再者，對于成年骨質(zhì)疏松動(dòng)物四肢骨原代成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，針對上述問題提供一種骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法及應(yīng)用，通過利用大鼠骨質(zhì)疏松模型，采用純機(jī)械分離法獲得原代骨質(zhì)疏松長骨成骨細(xì)胞。所獲得的細(xì)胞在生化指標(biāo)方面具有骨質(zhì)疏松病理特性，并且能夠?qū)构琴|(zhì)疏松藥物及骨誘導(dǎo)材料產(chǎn)生積極響應(yīng)。本發(fā)明建立一種簡單而有效的骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞的提取方法。對研宄骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療有重要意義。
[0007]本發(fā)明從骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中獲取四肢骨的皮質(zhì)骨骨片，然后用培養(yǎng)基浸泡骨片通過貼壁法獲得骨質(zhì)疏松動(dòng)物原代成骨細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，取骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型的四肢骨，獲取皮質(zhì)骨骨片，在細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中用培養(yǎng)基浸泡所述骨片，使細(xì)胞從骨片邊緣爬出，進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿，收集貼壁生長的細(xì)胞，即獲得骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞。所述四肢骨為股骨或脛骨或腓骨中的至少一種。
[0009]作為可選方式，在上述方法中，采用純機(jī)械分離法，獲取皮質(zhì)骨骨片。成功避免了酶消化對于成骨細(xì)胞可能存在的不可逆的損傷及改變。
[0010]作為可選方式，上述方法包括以下步驟:
1)處死模型動(dòng)物，無菌條件下分離大鼠的股骨、脛骨、腓骨；
2)用消毒過的手術(shù)刀沿骨垢板閉合線切入，剝離并丟棄股骨、脛骨、腓骨生長端的骺板，徹底剔除骨上附著的肌肉組織；
3)在超凈臺(tái)內(nèi)將皮質(zhì)骨切割成骨片，棄兩端，用含雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，并通過震蕩徹底洗脫骨髓腔內(nèi)殘余的其他細(xì)胞，使骨片最終呈現(xiàn)乳白色；
4)在細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中用培養(yǎng)基浸泡所述骨片；
5)收集貼壁生長的細(xì)胞。
[0011]作為可選方式，在上述方法中，采用茜素紅(Alizarin Red)染色及堿性磷酸酶(ALP)定量分析對所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
[0012]作為可選方式，上述方法包括以下步驟:
O處死模型動(dòng)物，無菌條件下分離大鼠的股骨、脛骨、腓骨；
2)用消毒過的手術(shù)刀沿骨垢板閉合線切入，剝離并丟棄股骨、脛骨、腓骨生長端的骺板，徹底剔除骨上附著的肌肉組織；
3)在超凈臺(tái)內(nèi)將皮質(zhì)骨切割成約2mmX2mm的骨片，棄兩端，用含雙抗(青鏈霉素混合液)的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗數(shù)次，并用振蕩法徹底洗脫骨髓腔內(nèi)殘余的其他細(xì)胞，使骨片最終呈現(xiàn)乳白色；
4)將骨片按每孔6-10片接種于血清包被的6孔板內(nèi)，每孔加入含有1%L-抗壞血酸、1%雙抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培養(yǎng)基5mL，浸泡全部骨片，避免骨片飄起；
5)5天后進(jìn)行不完全換液:留存l_2ml原培養(yǎng)基，補(bǔ)充3ml新培養(yǎng)基(半量換液既可以除去代謝產(chǎn)物又可以適量保留前期培養(yǎng)中累積的促生長物質(zhì)，同時(shí)避免了因全部換液造成的胞外環(huán)境的波動(dòng)，利于原代培養(yǎng));
6)12-15天后進(jìn)行常規(guī)傳代，每孔接種IX15個(gè)細(xì)胞(6孔板)，即獲得骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞。
[0013]作為可選方式，在上述方法中，所述骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方式為:取成年雌鼠用維甲酸誘導(dǎo)建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型；或取成年雌鼠吊尾飼養(yǎng)60天；或取成年雌鼠切除兩側(cè)卵巢后，飼養(yǎng)90天；或直接取年齡在24個(gè)月以上的雌性大鼠。
[0014]本發(fā)明還提供了一種采用上述方法獲取的骨質(zhì)疏松大鼠原代成骨細(xì)胞。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞呈三角形或梭形，輪廓清晰，折光好。
[0015]本發(fā)明還提供了一種上述細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，將其作為篩選骨質(zhì)疏松藥物和\或植入材料的細(xì)胞模型。
[0016]作為可選方式，在上述應(yīng)用中，將所述細(xì)胞與被篩選的對象共培養(yǎng)后，檢測細(xì)胞的成骨指標(biāo)。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快速的骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法及其應(yīng)用方向。采用純機(jī)械分離法獲得原代骨質(zhì)疏松長骨成骨細(xì)胞，成功避免了膠原酶消化對于成骨細(xì)胞可能存在的不可逆的損傷及改變。所獲得的細(xì)胞在生化指標(biāo)方面具有骨質(zhì)疏松病理特性，并且能夠?qū)构琴|(zhì)疏松藥物及骨誘導(dǎo)材料產(chǎn)生積極響應(yīng)。
[0018]【附圖說明】:
圖1為實(shí)施例1中所述動(dòng)物在建模前(左)和建模后(右)的顯微CT照片。顯示維甲酸灌胃15天后出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理學(xué)改變(脛骨近端)。
[0019]圖2為實(shí)施例1中所述骨片培養(yǎng)5天后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下觀察的照片?？捎^察到有細(xì)胞從骨片邊緣爬出。
[0020]圖3為實(shí)施例1中所述骨片培養(yǎng)12-15天后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下觀察的照片?？梢娂?xì)胞逐漸爬滿孔板底部，可傳代。
[0021]圖4為實(shí)施例1中采用茜素紅染色后在放大倍數(shù)為10倍的光鏡下觀察的照片。鑒定結(jié)果為成骨細(xì)胞，骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)少于健康組。
[0022]圖5為實(shí)施例1中采用堿性磷酸酶定量分析所得的柱狀圖。鑒定為成骨細(xì)胞，骨質(zhì)疏松組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性少于健康組。
[0023]圖6為實(shí)施例1骨質(zhì)疏松骨提取的成骨細(xì)胞與1nM雌激素和羥基磷灰石材料共培養(yǎng)后，進(jìn)行堿性磷酸酶定量分析所得的柱狀圖。顯示共培養(yǎng)后堿性磷酸酶活性均有顯著性提升，趨近于健康組水平。
[0024]【具體實(shí)施方式】:
以下通過實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)當(dāng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)做的任何修改，以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的等同替換或者改進(jìn)，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0025]實(shí)施例1
I)選擇2-3月齡體重在250克左右的Sprague Dawle雌鼠，飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)環(huán)境。以維甲酸70mg/kg灌胃15天后，骨質(zhì)疏松模型造模成功。經(jīng)顯微CT (micro_