促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞體外克隆形成及分化能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞體外克隆形成及分化能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]造血干細(xì)胞(HSC)主要存在于骨髓、胚胎肝臟、臍帶血及外周血中，是能分化發(fā)育成各系血細(xì)胞的最原始細(xì)胞，具有高度自我更新、擴(kuò)增和定向分化的潛能。目前，HSC移植是血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、先天遺傳性等疾病最有效的治療方法，因此，HSC的相關(guān)基礎(chǔ)研宄為人類干細(xì)胞的開拓應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。小鼠HSC的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕畜w內(nèi)造血重建、體外克隆形成及誘導(dǎo)定向分化等方法。在體外克隆形成及誘導(dǎo)定向分化等實(shí)驗(yàn)中，血清的質(zhì)量是影響HSC擴(kuò)增生長狀況的重要因素，此類實(shí)驗(yàn)對(duì)血清的質(zhì)量要求較高，采用何種血清培養(yǎng)HSC且成功誘導(dǎo)其定向分化是研宄難點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對(duì)上述研宄領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞體外克隆形成及分化能力的方法，通過該方法可明顯促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞定向分化為T淋巴細(xì)胞。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清在誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞(尤其是小鼠骨髓造血干細(xì)胞)定向分化為T細(xì)胞中的應(yīng)用，所述原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清是通過以下方法制備得到的:將胎牛臍帶血(無菌采集得到)室溫靜置12h后分離收集血清，將每頭份血清依次進(jìn)行內(nèi)毒素、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗原、抗體檢測，將檢測結(jié)果均為陰性的血清混合，0.1 μπι微孔濾膜過濾除菌并分裝，-20°C保存即可。
[0006]一種利用原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞(尤其是小鼠骨髓造血干細(xì)胞)定向分化為T細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0007](I) OP9-DL1細(xì)胞用含10 % (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將OP9-DL1細(xì)胞消化后調(diào)細(xì)胞濃度為I X 15個(gè)/mL,取Iml接種于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80?90%時(shí)，吸棄上清，加入骨髓Lin-細(xì)胞(骨髓造血干細(xì)胞)，用含20% (體積百分?jǐn)?shù))原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清的IMDM培養(yǎng)基將骨髓Lin-細(xì)胞懸起，調(diào)整骨髓Lin-細(xì)胞終濃度為I X 15個(gè)/mL，接入培養(yǎng)板中，加入終濃度為5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5 %CO2、37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0008](2)培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)板中的Lin-細(xì)胞用移液器吹打后經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾至50mL離心管中，350g離心6min收集細(xì)胞沉淀；
[0009](3)用含體積分?jǐn)?shù)20%原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清的MDM培養(yǎng)基懸起細(xì)胞沉淀，調(diào)細(xì)胞濃度為I X 15個(gè)/mL，取2mL細(xì)胞懸液，接入新的OP9-DL1單細(xì)胞層，并補(bǔ)充FLT-3L至終濃度為5ng/mL，補(bǔ)充IL-7至終濃度為5ng/mL，5% CO2、37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0010]所述新的OP9-DL1單細(xì)胞層是通過以下方法制備得到的:OP9-DL-l細(xì)胞用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將OP9-DL1細(xì)胞消化后調(diào)細(xì)胞濃度為I X 15個(gè)/mL，取Iml接種于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80?90%時(shí)，吸棄上清，即得；
[0011](4)每3?4天更換一次新的OP9-DL1單細(xì)胞層(更換方式為步驟2、3所述的方法)，并補(bǔ)充FLT-3L至終濃度為5ng/mL，補(bǔ)充IL-7至終濃度為5ng/mL，5% C02、37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)13?20天，小鼠骨髓Lin-細(xì)胞即定向分化為T淋巴細(xì)胞，即得T淋巴細(xì)胞。
[0012]所述骨髓造血干細(xì)胞(小鼠骨髓造血干細(xì)胞)是通過以下方法得到的:
[0013](一 )骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲取:
[0014]I)取新鮮處死的動(dòng)物(小鼠)，分離四肢并剝離表皮后于IXPBS中，剪其雙腳后用紗布包裹揉搓除去脛骨及股骨所粘附的肌肉組織；
[0015]2)將分離的脛骨及股骨用I XPBS清洗兩遍，剪斷兩端使骨髓腔相通；
[0016]3)用注射器將骨髓腔中骨髓沖出，反復(fù)沖洗直至骨髓腔變白；
[0017]4)將沖出的骨髓細(xì)胞懸液過200目鋼網(wǎng)，去除殘余的骨組織或其他殘?jiān)?br>[0018]5)細(xì)胞懸液收集到離心管中，1200rpm，10min，4°C離心，同樣條件IXPBS再洗一次；
[0019]6)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，IXPBS洗一次，離心，細(xì)胞沉淀即為骨髓單個(gè)核細(xì)胞；
[0020]( 二)免疫磁珠分選Lin-細(xì)胞:
[0021]I)將上述所獲骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液離心，300g，1min,棄上清；
[0022]2)細(xì)胞沉淀每17細(xì)胞加入40uL PBE緩沖液；
[0023]3)每17細(xì)胞加入1uL生物素標(biāo)記的抗體；
[0024]4)混勻，4 ?8°C孵育 1min ；
[0025]5)每17細(xì)胞加入30uLPBE緩沖液；
[0026]6)每17細(xì)胞加入20uL抗生物素磁珠；
[0027]7)混勻，4 ?8°C孵育 15min ；
[0028]8)離心:300g，lOmin，棄上清；
[0029]9)每18細(xì)胞加入500uLPBE緩沖液；
[0030]10)進(jìn)行磁珠分選，流出的細(xì)胞為Lin-細(xì)胞。
[0031]本發(fā)明采用原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清用于小鼠骨髓HSC克隆形成及定向分化實(shí)驗(yàn)，并與國內(nèi)外幾種商品化的胎牛血清進(jìn)行了對(duì)比，成功得到了定向分化的T細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清在小鼠骨髓HSC克隆形成和定向分化實(shí)驗(yàn)中促細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)均優(yōu)于其他胎牛血清，提示此類血清的研發(fā)在該研宄領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0032]圖1:0P9_DL1細(xì)胞的細(xì)胞融合率達(dá)到80?90%時(shí)的示意圖。
[0033]圖2:原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞示意圖(200X)，其中，A圖、B圖、C圖、D圖分別表示A組、B組、C組、D組的骨髓單個(gè)核細(xì)胞示意圖。
[0034]圖3:Front胎牛血清培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞示意圖(200X)，其中，A圖、B圖、C圖、D圖分別表示A組、B組、C組、D組的骨髓單個(gè)核細(xì)胞示意圖。
[0035]圖4:原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清培養(yǎng)的骨髓Lin-細(xì)胞示意圖(100X)，其中，A圖、B圖、C圖、D圖分別表示A組、B組、C組、D組的骨髓Lin-細(xì)胞示意圖。
[0036]圖5 !Front胎牛血清培養(yǎng)的骨髓Lin-細(xì)胞示意圖(100X)，其中，A圖、B圖、C圖、D圖分別表示A組、B組、C組、D組的骨髓Lin-細(xì)胞示意圖。
[0037]圖6:Front胎牛血清培養(yǎng)的骨髓Lin-細(xì)胞向T細(xì)胞分化的流式分析示意圖(培養(yǎng)7天)。
[0038]圖7:原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清培養(yǎng)的骨髓Lin-細(xì)胞向T細(xì)胞分化的流式分析示意圖，其中，A圖:培養(yǎng)13天；B圖:培養(yǎng)20天。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0040]下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。
[0041]實(shí)施例小鼠骨髓HSC克隆形成及定向分化實(shí)驗(yàn)
[0042]實(shí)驗(yàn)材料:
[0043](I)動(dòng)物:C57BL/6J小鼠，6周齡，雄性，購自北京華阜康公司。
[0044](2)試劑:
[0045]小鼠重組細(xì)胞因子SCF ；IL-3 ；GM-CSF ;M_CSF ;IL_7 和 FLT-3L 購自 P^ro Tech 公司，按照說明書要求，濃度配制為Ing/μ L。
[0046]血清:Gibco (美國)胎牛血清；Bovogen(澳大利亞)胎牛血清；Front (美國)胎牛血清；四季青(杭州)胎牛血清；原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清(濟(jì)南勁牛生物科技有限公司制備，制備方法:無菌采集胎牛臍帶血，室溫靜置12h后分離收集血清，將每頭份血清依次進(jìn)行內(nèi)毒素、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗原、抗體檢測等，將檢測結(jié)果均為陰性的血清混合，
0.1 ym微孔濾膜過濾除菌并分裝，-20°c保存即可)。
[0047]a -MEM及MDM培養(yǎng)基(Gbico公司)按說明書配制。
[0048]甲基纖維素(sigma公司)，加入雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，濃度?% (V/V)，常規(guī)高壓滅菌。
[0049]流式抗體:PE-ant1-MouseCD25 (clone:PC61.5)、APC-ant1-Human/MouseCD44 (clone:IM7)，均購自 eB1science 公司。
[0050]免疫磁珠Lin-細(xì)胞分選試劑盒購自德國美天旎公司，0.5% PBE緩沖液(PH7.2):由 IxPBS 和 0.5% BSA(Sigma 公司)、2mMEDTA(Sigma 公司)配制而成。
[0051]0P9-DL1細(xì)胞來源于0Ρ/0Ρ小鼠，由清華大學(xué)腫瘤免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0052]0P9-DL1細(xì)胞或共孵育培養(yǎng)基配方:血清(Front胎牛血清)56°C熱滅活30min，取50mL血清加入到450mL a -MEM培養(yǎng)基中。
[0053]FACSCalibur型流式細(xì)胞儀:BD公司。
[0054]實(shí)驗(yàn)方法:
[0055](一 )骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲取:
[0056]I)眼球摘除放血法處死小鼠，分離小鼠四肢并剝離表皮后于IXPBS中，剪其雙腳后用紗布包裹揉搓除去脛骨及股骨所粘附的肌肉組織。
[0057]2)將分離的脛骨及股骨用IXPBS清洗兩遍，剪斷兩端使骨髓腔相通。
[0058]3)用ImL注射器將骨髓腔中骨髓沖出，反復(fù)沖洗直至骨髓腔變白。
[0059]4)將沖出的骨髓細(xì)胞懸液過200目鋼網(wǎng)，去除殘余的骨組織或其他殘?jiān)?br>[0060]5)細(xì)胞懸液收集到50mL離心管中，1200rpm，10min，4°C離心，同樣條件IXPBS再洗一次。
[0061]6)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，IXPBS洗一次，離心，細(xì)胞沉淀即為小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0062]( 二)免疫磁珠分選Lin-細(xì)胞:
[0063]I)將所獲小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液離心，300g，1min,棄上清。
[0064]2)細(xì)胞沉淀每17細(xì)胞加入40uL PBE緩沖液。
[0065]3)每17細(xì)胞加入1uL生物素標(biāo)記的抗體。
[0066]4)混勻，4 ?8°C孵育 lOmin。
[0067]5)每17細(xì)胞加入30uLPBE緩沖液。
[0068]6)每17細(xì)胞加入20uL抗生物素磁珠。
[0069]7)混勻，4 ?8°C孵育 15min。
[0070]8)離心:300g，lOmin，棄上清。
[0071]9)每18細(xì)胞加入500uLPBE緩沖液。
[0072]10)進(jìn)行磁珠分選。流出的細(xì)胞即為Lin-細(xì)胞。
[0073](三)骨髓單個(gè)核細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn):
[0074]I)分別用含20% (體積分?jǐn)?shù))Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清、Front胎牛血清、四季青胎牛血清、原代細(xì)胞培養(yǎng)專用血清的2X MDM培養(yǎng)基將經(jīng)免疫磁珠分選獲取的單個(gè)核細(xì)胞懸起，調(diào)細(xì)胞終濃度為2 X 15個(gè)/mL，根據(jù)分組加入不同的細(xì)胞因子混勻(每組加入的細(xì)胞因子情況見下述步驟)，細(xì)胞懸液與等體積的3%甲基纖維素混勻。
[0075]2)將上述細(xì)胞懸液，接種到12孔板中，每孔2mL，細(xì)胞終濃度為I X 15個(gè)/mL。分組:A、con ;B、SCF+FLT-3L ;C、SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF ;D、SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF ；每組2復(fù)孔，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞因子濃度為SCF:20ng/mL ;FLT_3L:10ng/mL ；IL-3:10ng/mL ;GM_CSF:20ng/mL ;M_CSF:20ng/mLo
[0076]3)每天鏡下觀察克隆形成情況并拍照。
[0077](四)Lin-細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)