Retroactive基因及其dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及飛幢Retroactive基因及其dsRNA在害蟲防 治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 飛蝗是我國歷史上重要的農(nóng)業(yè)害蟲，蝗災(zāi)暴發(fā)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅。目前對(duì) 其防治主要依靠化學(xué)殺蟲劑。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法不僅污染農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，同時(shí)對(duì)天敵及 高等動(dòng)物等非靶標(biāo)生物為害嚴(yán)重，因此，研發(fā)害蟲綠色防控新技術(shù)已成為農(nóng)業(yè)科技工作者 的重要課題。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，RNAi 技術(shù)自2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)以來，一直是生物科學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。該技術(shù)不僅為基因 功能研宄提供了實(shí)質(zhì)性的技術(shù)突破，而且在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面也具有極大的應(yīng)用潛力。與 傳統(tǒng)的化學(xué)防治相比較，基于RNAi技術(shù)的害蟲防治方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢：由于dsRNA只作 用于特定的靶標(biāo)序列，對(duì)非靶標(biāo)生物無影響；RNA在自然界中容易降解，所以不存在殘留問 題，環(huán)境安全性好。因此RNAi技術(shù)是未來植物保護(hù)領(lǐng)域害蟲生物防治的重要發(fā)展方向。
[0004] 表皮在昆蟲生長發(fā)育中起著重要的作用，幾丁質(zhì)是表皮的主要成分。表皮幾丁質(zhì) 的有序排列是保證昆蟲表皮發(fā)揮正常生理功能的保障。由于人和其他高等動(dòng)物體內(nèi)沒有幾 丁質(zhì)，針對(duì)幾丁質(zhì)篩選的分子靶標(biāo)用于害蟲防治相對(duì)安全。Rtv基因負(fù)責(zé)昆蟲表皮幾丁質(zhì)有 序排列，因此，本發(fā)明基于RNAi篩選獲得的Rtv基因?yàn)楹οx防治提供了一種環(huán)境友好的新 型害蟲防治分子靶標(biāo)和基于RNAi技術(shù)的害蟲防治新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種飛蝗Rtv基因和合成的dsRNA的方法以及合成dsRNA 在害蟲防治中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種飛蝗Rtv基因，其核苷酸序列為SEQ IDNO :1所示的序列。該基 因核苷酸序列的獲得是采用GeneDoc軟件對(duì)從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的片段進(jìn)行 拼接和比對(duì)，基于搜索獲得的片段，采用primer premier5. 0軟件分別設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID N0:3和下游引物SEQ IDN0:4,并將其送往公司合成。采用PCR擴(kuò)增獲得一條長度為482bp 的片段，經(jīng)過試劑盒純化后的PCR產(chǎn)物與T3載體連接，后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，挑取白斑 在含有氨芐霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后進(jìn)行菌液檢測，將檢測含有目的條帶的 菌液分出200 y 1送入公司測序，剩下的菌液用于提取質(zhì)粒并保存于-80°C超低溫冰箱中。 測序獲得Rtv基因的全長序列為482bp，其核苷酸序列為SEQ IDNO :1所示。
[0007] 本發(fā)明提供一種飛蝗Rtv基因編碼的氨基酸序列，其特征是SEQ IDNO :2所示的 序列。該氨基酸序列的獲得是采用ExPaSy在線軟件將SEQ IDNO: 1翻譯為相應(yīng)的氨基酸， 并對(duì)相對(duì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明Rtv基因編碼153個(gè)氨基酸，相對(duì)分子 量為17KD，理論等電點(diǎn)為6. 55。
[0008] 本發(fā)明提供飛蝗Rtv基因片段dsRNA的合成方法及其在害蟲防治中的應(yīng)用：基 于Rtv基因SEQ ID NO :1序列，采用primer premier5. 0軟件設(shè)id對(duì)含有17啟動(dòng)子的 引物，上游引物和下游引物分別如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，PCR擴(kuò)增獲得一段 長度為416bp的兩端均為17啟動(dòng)子的DNA片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:7所示的 序列。試劑盒純化的PCR產(chǎn)物做為模板用于合成dsRNA，采用I7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。使用微量進(jìn)樣器將合成的dsRNA注射進(jìn)入 飛蝗體腔內(nèi)，檢測dsRNA對(duì)Rtv基因表達(dá)的影響，并觀察dsRNA對(duì)飛蝗蛻皮發(fā)育的影響。結(jié) 果表明，dsRNA降低飛蝗Rtv基因的mRNA表達(dá)，同時(shí)dsRNA影響飛蝗正常蛻皮，使飛蝗出現(xiàn) 蛻皮困難從而難以到達(dá)下一齡期。dsRNA對(duì)飛蝗具有致死效應(yīng)。
[0009] 飛蝗Rtv基因片段合成的dsRNA對(duì)飛蝗致死原因研宄：將Rtv基因合成的dsRNA 注射進(jìn)入飛蝗體腔中，將其表皮解剖下來，并對(duì)表皮進(jìn)行透射電鏡觀察，注射合成dsRNA飛 蝗組的表皮幾丁質(zhì)致密排列的層狀結(jié)構(gòu)消失。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：針對(duì)飛蝗Rtv基因片段合成的dsRNA對(duì)飛蝗具有致死的作用， 表現(xiàn)為注射特異性dsRNA的飛蝗出現(xiàn)翅芽張開、但蟲體難以擺脫舊表皮的束縛，最終背部 弓起并死亡。死亡率達(dá)到91. 2%。本發(fā)明基于飛蝗Rtv合成特異性的dsRNA對(duì)飛蝗高致死 性的特點(diǎn)為篩選高效分子靶標(biāo)提供便利，可為害蟲防治提供新型綠色環(huán)保的方法。
【附圖說明】
[0011] 圖1 :飛蝗Rtv基因全長克隆的PCR擴(kuò)增檢測（1所示為DL5000DNA Marker，條帶 大小從下到上依次為 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，2 所示為 Rtv 基因 cDNA條帶）
[0012] 圖2 :dsRNA對(duì)飛蝗Rtv基因表達(dá)影響（1為注射dsGFP的對(duì)照組，2為注射dsRNA 的處理組）。0-actin為內(nèi)參基因。其中*P〈0. 05，#P〈0. 01。
[0013] 圖3 :dsRNA對(duì)5齡飛蝗若蟲蛻皮發(fā)育的影響（1為注射dsGFP的對(duì)照組，2和3均 為注射dsRNA的處理組）。處理組飛蝗出現(xiàn)翅芽張開、但蟲體難以擺脫舊表皮的束縛，最終 背部弓起并死亡。
[0014] 圖4 :dsRNA對(duì)飛蝗表皮幾丁質(zhì)超微結(jié)構(gòu)影響。實(shí)驗(yàn)組飛蝗表皮幾丁質(zhì)致密排列的 層狀結(jié)構(gòu)消失。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1:飛蝗Rtv基因全長cDNA序列及編碼氨基酸
[0016] 1.飛蝗Rtv基因搜索
[0017] 采用生物信息學(xué)方法從飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中對(duì)Rtv基因進(jìn)行搜索，使用NCBI數(shù) 據(jù)庫的Blastx進(jìn)行同源性分析，確定篩選獲得1條飛蝗Rtv基因全長序列。
[0018] 2.飛幢Rtv基因全長cDNA驗(yàn)證
[0019] 基于上述的飛幢Rtv基因的全長序列，采用primer premier5. 0軟件設(shè)id段引 物用于全長克隆。其中上游引物CGTATGTCACAGTTACCATGAAAATC(SEQ ID N0:3)和下游引物 TTATCAGTTCACAAGCCAGTCTCC(SEQ N0:4)。引物合成由上海英濰捷基生物有限公司完成。
[0020] 選取生長健康、大小一致的5齡飛蝗若蟲，使用鋒利的解剖刀和鑷子將飛蝗的表 皮快速解剖下來并凍于液氮中保存。依照TaKaRaTrizol試劑盒將表皮中的RNA提取 出來。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，將其做為全長克隆所需模 板。通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠檢測獲得飛蝗Rtv基因的全長cDNA序列（圖1)，采用 GelExtroactionKit(Omega)對(duì)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接到pEASY_T3克隆載 體（全式金公司）上，