一種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7) 真核表達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP7)是IGFBP家族成員，它是一種分泌蛋白，在 人體內(nèi)多種組織、器官中都可檢測到其表達(dá)。IGFBPs能調(diào)控胰島素生長因子的生物利用度， 從而影響細(xì)胞生長、分化和增殖。IGFBP7可以影響多種人原癌基因的活化，從而抑制纖維母 細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞衰老。大量研宄已經(jīng)表明IGFBP7在肝癌、乳腺癌、結(jié) 腸癌和甲狀腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，可能是一種新的潛在腫瘤抑制因子。此外，Min-A Seol等也發(fā)現(xiàn)IGFBP7在膽管癌細(xì)胞和組織中均表達(dá)下調(diào)。
[0003] 盡管IGFBP7有望成為新的膽管癌治療靶向因子，但其蛋白半衰期短，清除率高， 難溶于水，分子量大，易失活，易降解，穩(wěn)定性差，非注射給藥生物利用度低，純化水平低，價 格高（lg可達(dá)十萬元以上）等問題，極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表 達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，并為胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7用于腫瘤基礎(chǔ)研宄和臨床治療提 供一種新型的基因藥物。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒序列如SEQ ID N0. 2所示，命名 為pIRES-ZsGreenl-IGFBP7真核表達(dá)質(zhì)粒。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)?？?用于制備抑制細(xì)胞增殖試劑。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)?？捎糜谥苽湟种?細(xì)胞侵襲試劑。
[0007] 上述真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0008] (1)提取HepGj^f壁細(xì)胞RNA作為模板，以SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的序 列為引物，構(gòu)建PMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒；
[0009] (2)在pMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒中加入酶切位點，酶切位點為BglII-IGFBP7-EcoRI， 以加入了酶切位點的PMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒為模版，以SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示 的序列為引物擴(kuò)增IGFBP7編碼區(qū)，然后將該編碼區(qū)克隆至pIRES2-ZsGreenl質(zhì)粒，構(gòu)建成 pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 真核表達(dá)質(zhì)粒。
[0010] 本發(fā)明通過將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，利用大腸桿菌自身機(jī)制進(jìn)行質(zhì)粒的大量 擴(kuò)增，避開了直接從細(xì)胞中進(jìn)行蛋白提取和純化中遇到的蛋白量低，成本高，易降解等弊 端。含目的基因的轉(zhuǎn)染菌的構(gòu)建和質(zhì)粒大提都保證了蛋白的持續(xù)表達(dá)，而且價格便宜。
[0011] 本發(fā)明構(gòu)建的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒（以下簡稱IGFBP7真 核表達(dá)質(zhì)粒），分子量低，只有5. 4Kbp，而且易溶于水，通過將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，利 用大腸桿菌自身機(jī)制進(jìn)行質(zhì)粒的大量擴(kuò)增，可長期保存，且菌種的保存確保了目的基因的 持續(xù)來源，價格低。通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也提高了生物利用度。
[0012] 總之，本申請通過構(gòu)建IGFBP7真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，探索內(nèi)源性 IGFBP7表達(dá)蛋白對惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等生物過程的影響，并為惡性腫瘤提供 一種新的基因治療手段。RT-PCR調(diào)取基因的方法極大地擴(kuò)充了 IGFBP7目的基因的來源， TA克隆的手段保證了目的基因片段的高度保守，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染也保證了 IGFBP7 的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，從而避免了外源蛋白的不穩(wěn)定性，從而為IGFBP7在惡性腫瘤中的治療及 在腫瘤中作用機(jī)制的研宄提供了一種新的基因制劑。
【附圖說明】
[0013] 圖 1 為 RT-PCR 調(diào)取 IGFBP7cDNA 電泳圖；
[0014] 圖2為pMD19-T-IGFBP7連接反應(yīng)的PCR鑒定圖；M:Marker ;1、2、3 :挑取的3個克 ??；
[0015] 圖3為pMD19-T-IGFBP7構(gòu)建后測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對圖；Sequence 0 : IGFBP7 正常序列；Sequence 1 :pMD19-T_IGFBP7 序列；
[0016] 圖4為pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7載體構(gòu)建時加入酶切位點時的PCR結(jié)果圖；
[0017] 圖5為pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7表達(dá)載體圖譜及酶切鑒定；
[0018] 圖6為pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7構(gòu)建后測序結(jié)果與IGFBP7正常序列進(jìn)行比對 圖；Sequence 0 :IGFBP7 正常序列；Sequence 1 :pIRES2-ZsGreenl_IGFBP7 序列；
[0019] 圖7為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h效果圖；a?空白對照組b. pIRES2-ZsGreenl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 c. pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；
[0020] 圖8為實施例2中各組細(xì)胞周期分布圖；A :KB組；B :NC組；C :IGFBP7組；
[0021] 圖9為實施例3中轉(zhuǎn)染48h Transwell侵襲細(xì)胞染色圖（X400) ;A :空白對照組； B :pIRES-ZsGreenl 轉(zhuǎn)染組；C :pIRES-ZsGreenl-IGFBP7 組。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] pIRES-ZsGreenl_IGFBP7真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0024] 1材料和方法
[0025] 1. 1 材料
[0026] 主要試劑：限制性內(nèi)切酶（MBI、NEB)，T4DNA 連接酶（Takara)，pMD-19T-Simple 試 劑盒（Takara)，pIRES-ZsGreenl質(zhì)粒（Yrbio)，質(zhì)粒小量提取試劑盒（YRBIO)，DNA凝膠回 收試劑盒（YRBI0)，dNTP、Taq酶及buffer (NEB)，瓊脂糖（西班牙），DNA Marker (全式金）， 酵母粉（Oxide)，胰蛋白胨（Oxide)。
[0027]主要儀器：超凈工作臺（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司），微量移液器（德國 Eppendorf公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），電子天平（德國 精密儀器廠），PCR儀（德國Eppendorf公司），水平電泳槽（北京六一儀器廠），凝膠成像 系統(tǒng)（美國KODAK公司），恒溫水浴鍋（海爾公司），微波爐（LG)，AqUapr〇超級純水儀（艾 科浦），制冰機(jī)FM130 (GRANT)，立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠），LP115型 pH 計（德國 Metter-Toledo GmbH 公司）
[0028] 1. 2pMD19 - T - IGFBP7 質(zhì)粒構(gòu)建
[0029] 1.2.1引物設(shè)計
[0030] Genbank數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)薎GFBP7mRNA序列，讀取IGFBP7CDS區(qū)序列，設(shè)計引物為：
[0031] Forward :5,-ATGGAGCGGCCGTCGCTGC-3,（SEQ ID N0. 3);
[0032] Reverse :5,-TTATAGCTCGGCACCTTCACCTT-3,（SEQ ID NO. 4);
[0033] Product ：Length = 849bp, GC%= 64. 1, Ta = 60. 5
[0034] 1. 2. 2RNA 提取
[0035] TRIgol試劑提取RNA :l)IfepGj占壁細(xì)胞用0? 25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重 懸后收集至l〇ml離心管，5-10X 106/管，4000r/min，離心3min，重復(fù)清洗兩次；2)加入lml Trigol，充分混勻，移入1. 5ml EP管中，室溫靜置5min充分裂解；3)加入0. 2ml氯仿，振蕩 20s后室溫靜置15min ;4)4°C離心，12000gX 15min，吸取上清；5)加入0. 5ml異丙醇，輕搖 混勻，室溫靜置20min ;6)4°C離心，12000gX10min，棄上清；7)緩慢加入lml 75%乙醇，清 洗沉淀；8)4°C離心，12000gX5min，盡量棄盡上清；9)室溫干燥5min后，加入30yL DEPC 水溶解。
[0036] 1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA提取結(jié)果，電泳條件：60~80V 30min。
[0037] 1. 2. 3RT - PCR
[0038] 1) RT 反應(yīng)體系見表 1 (RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit#K1621，）
[0039] 表 1
【主權(quán)項】
1. 一種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述胰島素樣生長 因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒序列如SEQ ID NO. 2所示，命名為pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 真核表達(dá)質(zhì)粒。
2. 如權(quán)利要求1所述真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 提取H印62貼壁細(xì)胞RNA作為模板，以SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示的序列為 引物，構(gòu)建PMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒，所述pMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒序列如SEQIDNO. 1所示； (2) 在pMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒中加入酶切位點，酶切位點為BglII-IGFBP7-EcoRI，以 加入了酶切位點的PMD19-T-IGFBP7質(zhì)粒為模版，以SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示的 序列為引物擴(kuò)增IGFBP7編碼區(qū)，然后將該編碼區(qū)克隆至pIRES2-ZsGreenl質(zhì)粒，構(gòu)建成 pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 真核表達(dá)質(zhì)粒。
3. 如權(quán)利要求1所述真核表達(dá)質(zhì)粒在制備抑制細(xì)胞增殖試劑中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述真核表達(dá)質(zhì)粒在制備抑制細(xì)胞侵襲試劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)粒，其序列如SEQ ID NO.2所示，命名為pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7真核表達(dá)載體。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)?？捎糜谥苽湟种萍?xì)胞增殖試劑。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7真核表達(dá)質(zhì)?？捎糜谥苽湟种萍?xì)胞侵襲試劑。
【IPC分類】C12N15-12, A61K48-00, A61P35-00, C12N15-85, A61K38-17
【公開號】CN104789591
【申請?zhí)枴緾N201410829801
【發(fā)明人】彭健, 岳春燕, 胥洪鵑, 廖明媚, 楊滿意
【申請人】中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2014年12月26日