一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代研宄發(fā)現(xiàn)，幾乎所有疾病的產(chǎn)生都和自由基有關(guān)。自由基具有高度的活潑性 和極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力。目前，天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和利用已經(jīng)普遍展開(kāi)，就我國(guó)而言，存 在種類(lèi)單一，生產(chǎn)力較低，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差的弊端。生物活性肽以其用量少、活性強(qiáng)的獨(dú)特 優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越引起人們重視，其工業(yè)化生產(chǎn)也成為當(dāng)前食品和醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的大趨勢(shì)?，F(xiàn)已 報(bào)道國(guó)內(nèi)外從食物蛋白源中酶解或提取具有抗氧化活性的肽有大豆肽、玉米肽、青雪肽等。
[0003] 蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris L. Link)又名北冬蟲(chóng)夏草，是我國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用真 菌。蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草素、腺苷、蟲(chóng)草多糖、SOD等多種活性成分，具有降血糖、降血脂、抗菌、 抗癌、提高免疫力等多種功效。目前，對(duì)蛹蟲(chóng)草的研宄主要集中在活性成分的提取、分離純 化及藥理、藥效上。市場(chǎng)上已有多種蛹蟲(chóng)草制品，如蟲(chóng)草茶、蟲(chóng)草酒、蟲(chóng)草飲料和各類(lèi)膠囊、 片劑；生物活性肽日本以為功能因子已經(jīng)開(kāi)發(fā)出嬰兒食品、運(yùn)動(dòng)食品、降壓食品等系列食 品；生物活性肽國(guó)內(nèi)以三九集團(tuán)有限公司為代表，也開(kāi)發(fā)出多種保健品，如"三九蛋白肽"、 "三九大豆多肽"、"三九降糖肽"等。蛹蟲(chóng)草富含蛋白質(zhì)30%以上，卻很少作為功能因子開(kāi) 發(fā)利用。有關(guān)蛹蟲(chóng)草多肽的研宄，見(jiàn)錢(qián)衛(wèi)文等采用蛋白酶水解經(jīng)脫脂、制粉后的蛹蟲(chóng)草粉， 制的多肽含量40%~60%。
[0004] 獲得生物活性肽主要有三種方式：1、從組織器官中提取的天然活性肽，提取過(guò)程 繁瑣；2、人工合成的多肽，存在多種化合物殘留問(wèn)題；3、體外水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)活性肽。目 前，利用動(dòng)植物蛋白制備抗氧化肽主要采用酸水解或酶解法，此兩種方法存在水解時(shí)間長(zhǎng)、 水解效率低下，產(chǎn)物與蛋白不易分離等缺陷，因而成為限制抗氧化肽市場(chǎng)化應(yīng)用的障礙。
[0005] 發(fā)酵法制備蛹蟲(chóng)草抗氧化肽，是利用蛹蟲(chóng)草納米微粒直接發(fā)酵，省去蛹蟲(chóng)草蛋白 質(zhì)提取繁瑣工藝，同時(shí)，通過(guò)微生物自身的復(fù)合酶系可以酶解釋放出高濃度、分子量分布較 為集中的活性肽，提高水解率，增加酶解產(chǎn)物抗氧化活性。目前，將納米技術(shù)結(jié)合微生物發(fā) 酵對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行深加工的研宄未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)弊端，提供一種高效、低成本、生產(chǎn)周期短、適用 于規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的 方法，其特征是，它包括以下步驟：
[0008] (1)將蛹蟲(chóng)草經(jīng)溫度60~80°C烘干，粗粉碎過(guò)40目篩，再納米粉碎3~5h，制得 蛹蟲(chóng)草納米微粒；
[0009] (2)按蛹蟲(chóng)草納米微粒與蒸餾水1 :20比例，將蛹蟲(chóng)草納米微粒5g加入到蒸餾水 lOOmL中，搖勻，自然PH值，在高壓滅菌鍋中121°C滅菌20~30min，制得種子培養(yǎng)基；
[0010] (3)在燒杯中加入蒸餾水100ml，放入牛肉膏0. 3g，蛋白胨l.Og，氯化鈉0. 5g，PH 在6~7,121°C高壓蒸汽滅菌20~30min，冷卻制得普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將地衣芽孢 桿菌菌株斜面菌種接種普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于30~40°C，培養(yǎng)1~2d制得接種活化 好的地衣芽孢桿菌，將活化好的地衣芽孢桿菌5g接入步驟（2)所述的種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn) 速140r/min條件下，搖床培養(yǎng)4~6d，冷至室溫，在4000r/min條件下，離心15/min制得抗 氧化肽成品。
[0011] 所述的地衣芽孢桿菌菌株為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為： CCTCCN0:M208251。
[0012] 本發(fā)明發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法的有益效果如下：
[0013] 1.制備的抗氧化肽制劑含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、微量元素、人體必需的氨 基酸等，不含任何有害物質(zhì)；
[0014] 2,制備的抗氧化肽制劑含有豐富的功能活性成分，如蟲(chóng)草素、腺苷、蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng) 草酸等，具有顯著的抗氧化功效，可提高人體免疫力、抗腫瘤、抗病毒；
[0015] 3.以蛹蟲(chóng)草為直接發(fā)酵基質(zhì)，制備方法簡(jiǎn)化，適用于規(guī)?；a(chǎn)，以地衣芽孢桿菌 替代大量昂貴的酶制劑，生產(chǎn)成本低，多肽得率高；
[0016] 4.制備的抗氧化肽制劑可作為功能食品、抗氧化劑，亦可作為保健藥物開(kāi)發(fā)利用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1蛹蟲(chóng)草粉碎3h納米粒徑分布圖；
[0018] 圖2蛹蟲(chóng)草粉碎4h納米粒徑分布圖；
[0019] 圖3蛹蟲(chóng)草粉碎5h納米粒徑分布圖；
[0020] 圖4蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液蟲(chóng)草素、腺苷檢測(cè)譜圖；
[0021] 圖5蛹蟲(chóng)草抗氧化肽制劑氨基酸檢測(cè)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明的一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟：
[0023] (1)將蛹蟲(chóng)草經(jīng)溫度60~80°C烘干，粗粉碎過(guò)40目篩，再納米粉碎3~5h，制得 蛹蟲(chóng)草納米微粒；
[0024] (2)按蛹蟲(chóng)草納米微粒與蒸餾水1 :20比例，將蛹蟲(chóng)草納米微粒5g加入到蒸餾水 lOOmL中，搖勻，自然PH值，在高壓滅菌鍋中121°C滅菌20~30min，制得種子培養(yǎng)基；
[0025] (3)在燒杯中加入蒸餾水100ml，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨l.Og，氯化鈉0.5g，PH 在6~7,121°C高壓蒸汽滅菌20~30min，冷卻制得普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將地衣芽孢 桿菌菌株斜面菌種接種普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于30~40°C，培養(yǎng)1~2d制得接種活化 好的地衣芽孢桿菌，將活化好的地衣芽孢桿菌5g接入步驟（2)所述的種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn) 速140r/min條件下，搖床培養(yǎng)4~6d，冷至室溫，在4000r/min條件下，離心15/min制得抗 氧化肽成品。
[0026] 所述的地衣芽孢桿菌菌株為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為： CCTCCN0:M208251。
[0027] 參照?qǐng)D1-3,蛹蟲(chóng)草納米微粒的制備
[0028] (1)將蛹蟲(chóng)草經(jīng)溫度60~80°C烘干，粗粉碎過(guò)40目篩，加入納米球磨粉碎機(jī)中， 粉碎3~5h，即為蛹蟲(chóng)草納米微粒，經(jīng)納米粒徑分析儀檢測(cè)，圖1~圖3分別為蛹蟲(chóng)草粉碎 3h、4h、5h納米粒徑分布情況。
[0029] 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵的優(yōu)化
[0030] 1.響應(yīng)面法優(yōu)化菌株發(fā)酵
[0031] 按Central-composite設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)以隨機(jī)順序進(jìn)行。
[0032] 表1因素水平表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法，其特征是，它包括以下步驟： (1)將蛹蟲(chóng)草經(jīng)溫度60~80°C烘干，粗粉碎過(guò)40目篩，再納米粉碎3~5h，制得蛹蟲(chóng) 草納米微粒； ⑵按蛹蟲(chóng)草納米微粒與蒸餾水1 :20比例，將蛹蟲(chóng)草納米微粒5g加入到蒸餾水IOOmL中，搖勻，自然PH值，在高壓滅菌鍋中121°C滅菌20~30min，制得種子培養(yǎng)基； (3)在燒杯中加入蒸餾水100mL，放入牛肉膏0. 3g，蛋白胨I. 0g，氯化鈉0. 5g，PH在6~ 7,121°C高壓蒸汽滅菌20~30min，冷卻制得普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將地衣芽孢桿菌菌 株斜面菌種接種普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于30~40°C，培養(yǎng)1~2d制得接種活化好的地 衣芽孢桿菌，將活化好的地衣芽孢桿菌5g接入步驟（2)所述的種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速140r/ min條件下，搖床培養(yǎng)4~6d，冷至室溫，在4000r/min條件下，離心15/min制得抗氧化肽 成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法，其特征是， 所述的地衣芽孢桿菌菌株為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCCNO:M208251。
【專(zhuān)利摘要】一種發(fā)酵蛹蟲(chóng)草納米微粒制備抗氧化肽的方法，其特點(diǎn)是，將蛹蟲(chóng)草經(jīng)溫度60～80℃烘干，粗粉碎過(guò)40目篩，再納米粉碎3～5h，制得蛹蟲(chóng)草納米微粒；將蛹蟲(chóng)草納米微粒加入到蒸餾水中，搖勻，自然PH值，在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20～30min，制得種子培養(yǎng)基；在蒸餾水中放入牛肉膏,蛋白胨，氯化鈉,PH在6～7，121℃高壓蒸汽滅菌20～30min，冷卻制得普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將地衣芽孢桿菌菌株斜面菌種接種普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，于30～40℃，培養(yǎng)1～2d制得接種活化好的地衣芽孢桿菌，將活化好的地衣芽孢桿菌接種子培養(yǎng)基中，制得抗氧化肽成品。其制備方法高效、低成本、生產(chǎn)周期短、適用于規(guī)模化生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12R1-10, C12P21-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104789621
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510119338
【發(fā)明人】李金志, 李森, 楊淑芳, 韓建華, 劉雋彥, 朱興友, 孫繼紅, 薛強(qiáng), 靳向東
【申請(qǐng)人】吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年3月18日