大豆事件127和與其相關(guān)的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】大豆事件127和與其相關(guān)的方法
[0001] 本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2010年01月06日，申請(qǐng)?zhí)枮?201080011786. 7 (PCT/US2010/020252)，發(fā)明名稱(chēng)為"大豆事件127和與其相關(guān)的方法"。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求保護(hù)2009年1月7日提交的美國(guó)專(zhuān)利臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/143, 049的權(quán)益， 所述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此引作參考。
[0004] 經(jīng)由EFS-WEB提呈的序列表的引用
[0005] 本申請(qǐng)經(jīng)由EFS-Web電子提交，包括以文本文檔格式電子提交的序列表。該文本 文檔文件含有在2010年1月5日創(chuàng)建的標(biāo)題為" 1378358. txt"的序列表，為47, 052個(gè)字 節(jié)大小。該文本文檔文件中含有的序列表是本說(shuō)明書(shū)的部分，在此以其整體引作參考。
[0006] 領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)，涉及用于提高植物對(duì)抑制乙酰羥酸合成酶的除草劑 的耐受性的組合物及方法和用于雜草控制的組合物及方法。
[0008] 背景
[0009] 大豆（Glycine max)在世界上很多地區(qū)是重要作物。已將生物技術(shù)方法應(yīng)用于大 豆以改進(jìn)農(nóng)學(xué)性狀和產(chǎn)物質(zhì)量。在大豆生產(chǎn)中重要的一種這類(lèi)農(nóng)學(xué)性狀是對(duì)除草劑的耐受 性，尤其是對(duì)草甘膦除草劑的耐受性。隨著草甘膦耐受性大豆使用的擴(kuò)展，耐受草甘膦的雜 草也出現(xiàn)了。因此，為了控制雜草，需要耐受除草甘膦外的除草劑的大豆植物。
[0010] 植物例如大中轉(zhuǎn)基因（例如提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因）的表型表達(dá)，受到基 因本身結(jié)構(gòu)及其在植物基因組中的整合位置二者的影響。同時(shí)，基因組中不同位置的轉(zhuǎn)基 因（在外來(lái)DNA中）的存在，將以不同方式影響植物的總體表型。通過(guò)基因操作在農(nóng)藝方 面或工業(yè)方面成功地將商業(yè)上感興趣的性狀引入植物中，可能是取決于不同因素的漫長(zhǎng)過(guò) 程。遺傳轉(zhuǎn)化的植物實(shí)際上的轉(zhuǎn)化和再生僅是一系列選擇步驟的開(kāi)始，所述一系列選擇步 驟包括大量遺傳表征、育種和田間試驗(yàn)評(píng)估，最終通向選擇優(yōu)良事件（event)。
[0011] 因?yàn)樵谧魑锔牧贾性黾恿诉z傳修飾的使用以改進(jìn)轉(zhuǎn)基因向商業(yè)品種的基因滲入， 所以明確地檢測(cè)和/或鑒定特定轉(zhuǎn)基因事件的能力越來(lái)越重要，以便分開(kāi)GM0和非GM0產(chǎn) 品及鑒定專(zhuān)有物質(zhì)。仍然需要開(kāi)發(fā)既快速又簡(jiǎn)單不需大量實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的方法，用于檢測(cè)特 定轉(zhuǎn)基因事件。另外，用于檢測(cè)特定事件的方法在以下方面將有益：遵從規(guī)則，所述規(guī)則要 求對(duì)源自重組作物植物的食品進(jìn)行預(yù)先市場(chǎng)批準(zhǔn)和標(biāo)記；或用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、野外作物性狀 監(jiān)測(cè)或來(lái)自作物收獲物的產(chǎn)品的監(jiān)測(cè)；以及用于確保受監(jiān)管條款或合同條款管轄的各方遵 守。
[0012] 簡(jiǎn)述
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在栽培區(qū)控制雜草的方法，所述方法包括：將 有效量的非選擇性除草劑施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的栽培區(qū)。
[0014] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于控制作物田（crop field)中耐受草甘膦的雜 草的方法，所述方法包括：將有效量的抑制AHAS的除草劑施用于具有包含事件127核酸分 子的大豆植物的作物田。
[0015] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO :1的1312-6069位核酸序列的分 尚的核酸分子。
[0016] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明亦提供具有異源核酸分子的轉(zhuǎn)基因大豆植物，所述異 源核酸分子具有SEQ ID N0 :1的核苷酸1302-6079的核酸序列。
[0017] 本發(fā)明亦提供分離的核酸引物對(duì)，所述核酸引物對(duì)包含能夠擴(kuò)增事件127核酸分 子的第一和第二分離的核酸分子。
[0018] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定生物學(xué)樣品中的事件127核酸分子的試 劑盒，所述試劑盒包括第一和第二核酸引物，其中第一和第二核酸引物能夠擴(kuò)增事件127 核酸分子。
[0019] 本發(fā)明亦提供用于鑒定事件127大豆植物的方法，所述方法包括：(a)形成混合 物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物學(xué)樣品和能夠擴(kuò)增事件127特異性核酸分子的第 一和第二核酸引物；(b)在允許第一和第二核酸引物擴(kuò)增事件127特異性核酸分子的條件 下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)擴(kuò)增的片段核酸分子的存在情況，其中存在大豆事件127特 異性核酸分子，表明大豆植物為事件127大豆植物。
[0020] 在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定具有事件127核酸分子的大豆植物的方 法，所述方法包括：（a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物學(xué)樣品和能夠與 事件127特異性核酸分子雜交的核酸分子探針；(b)在允許核酸分子探針與事件127特異 性核酸分子雜交的條件下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)所述探針與DNA的雜交情況，其中存 在核酸分子探針與大豆DNA的雜交表明存在事件127核酸分子。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供用于提高包含事件127核酸分子的大豆植物的產(chǎn)量的方法，所 述方法包括：將有效量的抑制AHAS的除草劑施用于一種或多種包含事件127核酸分子的大 豆植物和周?chē)鷧^(qū)域，其中所述抑制AHAS的除草劑減少周?chē)鷧^(qū)域的雜草生長(zhǎng)；和從所述一種 或多種大S?植物收獲種子。
[0022] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于對(duì)耐受抑制AHAS的除草劑的大豆植物進(jìn)行 育種的方法，所述方法包括：(a)讓包含事件127核酸分子的大豆植物與第二種大豆植物雜 交；(b)從步驟（a)的雜種獲得種子；（c)從所述種子獲得DNA樣品；和（d)檢測(cè)樣品中事 件127核酸分子的存在情況，其中存在事件127核酸分子表明所述種子能夠產(chǎn)生耐受抑制 AHAS的除草劑的大豆植物。
[0023] 本發(fā)明亦提供包含事件127核酸分子的大豆植物的種子。
[0024] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中事件127核酸分子的存在 情況的方法，所述方法包括：（a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物學(xué)樣品和能 夠擴(kuò)增事件127特異性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允許第一和第二核酸引物 擴(kuò)增包含事件127特異性核酸分子的核酸分子的條件下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)擴(kuò)增的 核酸分子的存在情況，其中存在事件127特異性核酸分子表明樣品含有事件127核酸分子。
[0025] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的事件127核酸分子的方 法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物學(xué)樣品和能夠與事件 127特異性核酸分子雜交的核酸探針；(b)在允許探針與事件127特異性核酸分子雜交的條 件下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)雜交的核酸分子的存在情況，其中存在事件127特異性核 酸分子表明樣品含有事件127核酸分子。
[0026] 本發(fā)明亦提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中事件127插入核酸分子的存在情況的方法， 所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物學(xué)樣品和能夠擴(kuò)增事件 127插入核酸分子的第一和第二引物；(b)在允許第一和第二核酸引物擴(kuò)增包含事件127插 入核酸分子的核酸分子的條件下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)擴(kuò)增的核酸分子的存在情況， 其中存在事件127插入核酸分子表明樣品含有事件127插入DNA。
[0027] 在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中事件127插入核酸分子的 存在情況的方法，所述方法包括：(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物學(xué)樣品 和能夠與事件127插入核酸分子區(qū)退火的第一引物和能夠與宿主細(xì)胞基因組中的側(cè)翼核 酸分子退火的第二引物；(b)在允許第一和第二核酸引物產(chǎn)生包含事件127插入核酸分子 片段的擴(kuò)增核酸分子的條件下，讓混合物反應(yīng)；和（c)檢測(cè)擴(kuò)增的核酸分子的存在情況，其 中存在事件127插入核酸分子片段表明樣品含有事件127插入DNA。
[0028] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于栽培大豆植物的方法，所述方法包括：(a)提 供包含事件127核酸分子的大豆種子；(b)在允許種子發(fā)芽以產(chǎn)生生長(zhǎng)中的包含事件127 核酸分子的大豆植物的條件下，將大豆種子種植在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中；和（c)讓生長(zhǎng)培養(yǎng)基、種 子或植物與包含至少一種選自以下的組分的除草劑組合物接觸：咪唑啉酮除草劑、磺酰脲 除草劑、其彼此的組合及其與至少一種其它活性成分的組合。
[0029] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品中的事件127多肽的方法，所述方 法包括：從大豆植物獲得生物學(xué)樣品；和對(duì)樣品進(jìn)行至少一種免疫學(xué)測(cè)定，其中所述測(cè)定 能夠檢測(cè)事件127多肽。
[0030] 本發(fā)明亦提供用于檢測(cè)生物分子的裝置，所述裝置包括：具有表面的固相支持體； 和至少一種與固相支持體表面連接的事件127診斷分子。
[0031] 附圖簡(jiǎn)述
[0032] 圖1A提供質(zhì)粒pAC321的示意圖。圖1B提供用于轉(zhuǎn)化的含有AHASL 5'UTR、csrl-2 編碼序列和AHASL 3'UTR的pAC321的PvuII片段的示意圖。標(biāo)明了用于拷貝數(shù)、缺乏主鏈 和兩代間的穩(wěn)定性的DNA印跡分析的限制性酶位點(diǎn)（Ncol、Xbal、Spel)。
[0033] 圖2提供大豆事件127植物的一個(gè)實(shí)例的育種歷史的示意圖。
[0034] 圖3提供pAC321PvuII轉(zhuǎn)化片段與大豆事件127插入物的比對(duì)的示意圖。
[0035] 圖4A-4C提供實(shí)施例3中所述的大豆事件127植物的一個(gè)實(shí)例中插入物拷貝數(shù)的 DNA印跡雜交結(jié)果。圖4D提供用于雜交實(shí)驗(yàn)的探針的相對(duì)位置的示意圖。
[0036] 圖5提供顯示在實(shí)施例3中所述的大豆事件127植物的一個(gè)實(shí)例中缺乏載體主鏈 序列的DNA印跡雜交結(jié)果。圖5A提供用探針VP1的結(jié)果，圖5B提供用探針VP2的結(jié)果。圖 5C提供127事件序列上的雜交