一種水稻稻瘟病抗性基因Pik的分子標(biāo)記和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國(guó)重要的農(nóng)作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)定性直接關(guān)系到國(guó)計(jì)民生。稻瘟病是水稻的毀滅性病害，對(duì)水稻的產(chǎn)量造成重大影響，高抗稻瘟病的水稻一直是水稻新品種培育的關(guān)鍵目標(biāo)。目前，發(fā)掘廣譜稻瘟病抗性基因或主效QTL，通過(guò)聚合育種，培育廣譜持久抗病的水稻品種是控制稻瘟病的主要措施。由此，稻瘟病抗性基因的檢測(cè)以及稻瘟病抗性水稻種質(zhì)篩選就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的稻瘟病抗性檢測(cè)，是通過(guò)人工剪葉然后接種稻瘟病菌的方式鑒定，該方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性較差、周期較長(zhǎng)、技術(shù)條件要求高，無(wú)法滿足在育種低世代大群體的鑒定要求。最有效的抗性鑒定方法，應(yīng)是直接對(duì)稻瘟病抗性基因進(jìn)行選擇。
[0003]研宄表明，稻瘟病抗性基因Pik\iL于11染色體長(zhǎng)臂，對(duì)許多中國(guó)稻瘟病小種有較強(qiáng)的、穩(wěn)定的抗性。/?基因座位由兩個(gè)連續(xù)的NBS-LRR類基因(/^-7和AU)組成，兩個(gè)基因?qū)?々介導(dǎo)的稻瘟病抗性均必不可少。座位上已定位或克隆的抗性復(fù)等位基因包括 (供體 Kusabue )、Pikh (供體 Tetep )、Pik~H4 (供體 H4)、Pikp (供體 K60)、Pikm(供體Tsuyuake )、/7ZAs (供體Nor in)、/^7 (供體LAC23)等。盡管/7ZA座位的不同抗性復(fù)等位基因之間的抗譜有所差別，但抗性都較好。對(duì)應(yīng)日本晴(含感病等位基因/7^)基因組的兩個(gè)基因分別為 L0C_0sllg46200 ipikm5-NP)熱 L0C_0sllg46210 ipikm6_m.M Pik_2在不同等位基因之間相對(duì)較保守，可挖掘特異的變異SNP，用于開發(fā)標(biāo)記。發(fā)明人已克隆出水稻的抗性復(fù)等位基因的Pik-H4，將Pik-H雜L0C_0sllg46210進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在抗性復(fù)等位基因與日本晴pik.2173位堿基處存在SNP變異，其中抗性基因?yàn)門，而感病基因?yàn)镃。
[0004]四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR (ARMS-PCR)能夠針對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行特異等位擴(kuò)增。針對(duì)已知的變異位點(diǎn)，于兩側(cè)分別設(shè)計(jì)I對(duì)外引物和I對(duì)特異性內(nèi)引物，特異性引物3’末端堿基必須落在突變點(diǎn)的位置上，從而選擇性地?cái)U(kuò)增突變型與野生型個(gè)體基因。在同一次擴(kuò)增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同，通過(guò)產(chǎn)物片段分離的特定條帶的有無(wú)判別個(gè)體的基因型，是一種共顯性分型技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、分型快速、費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述技術(shù)缺陷，提供一種水稻稻瘟病抗性基因Pil^]分子標(biāo)記。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定水稻稻瘟病抗性基因礎(chǔ)勺基因型或/和水稻能否抗稻瘟病菌中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻稻瘟病抗性基因礎(chǔ)勺基因型的方法。
[0009]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供利用上述分子標(biāo)記檢測(cè)水稻能否抗稻瘟病菌或同時(shí)檢測(cè)水稻稻瘟病抗性基因的基因型和水稻能否抗稻瘟病菌的方法。
[0010]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:
一種水稻稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記由一對(duì)外引物Pik-O-F、Pik-O-R和一對(duì)內(nèi)引物Pik-T-F、Pik-C-R組成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0011]本發(fā)明所述分子標(biāo)記是針對(duì)基因編碼區(qū)第2173位堿基處存在T/C SNP變異設(shè)計(jì)得到；所述內(nèi)引物Pik-T-F、Pik-C-R的3’端第3個(gè)堿基引入了錯(cuò)配堿基。
[0012]本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻稻瘟病抗性基因基因型和/或水稻能否抗稻瘟病菌中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供了利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻稻瘟病抗性基因基因型的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測(cè)樣品DNA提??；
S2以樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用所述分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
S3分析PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，進(jìn)行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)184bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的為抗病基因型(T/T純合型)；若出現(xiàn)131bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的朽左為感病基因型(C/C純合型);若出現(xiàn)131bp、184bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的為雜合型(C/T雜合型)。
[0015]本發(fā)明還提供了利用上述分子標(biāo)記檢測(cè)水稻能否抗稻瘟病菌或同時(shí)檢測(cè)水稻稻瘟病抗性基因基因型和水稻能否抗稻瘟病菌的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測(cè)樣品DNA提取；
S2以樣品DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用上述分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
S3分析PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，進(jìn)行結(jié)果判定，所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)184bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的/?為抗病基因型，待測(cè)樣品為抗稻瘟病菌品種；若出現(xiàn)131bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的為感病基因型，待測(cè)樣品為感稻瘟病菌品種；若出現(xiàn)131bp、184bp和260bp條帶，則表明待測(cè)樣品的為雜合型，待測(cè)樣品為感稻瘟病菌品種。
[0016]優(yōu)選地，所述PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板 1.0 uL、Pik_T_F 0.4uL、Pik_C_R 0.4uL、Pik-O-F 0.4uL、Pik-O-R 0.4uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，其余由雙蒸滅菌水CddH2O)補(bǔ)足至 15uLo
[0017]優(yōu)選地，所述PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C 30sec，55°C 30sec，72°C30sec共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明基于ARMS-PCR原理，設(shè)計(jì)開發(fā)了一種擴(kuò)增片段適中、特異性強(qiáng)的水稻稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記，利用該標(biāo)記鑒定水稻稻瘟病抗性基因基因型，不需要經(jīng)過(guò)測(cè)序，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR即可對(duì)水稻稻瘟病抗性基因進(jìn)行基因分型，區(qū)分抗稻瘟病菌水稻品種和感病品種，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻稻瘟病的分子標(biāo)記輔助選擇，本發(fā)明所述分子標(biāo)記可提高基因的檢測(cè)效率，適合用于水稻改良分離群體的分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為功能性標(biāo)記Pik-C/T引物設(shè)計(jì)示意圖；其中等位變異位點(diǎn)分別以紅色背景標(biāo)識(shí)，弓I物錯(cuò)配堿基以下劃線標(biāo)識(shí)。
[0020]圖2為功能性標(biāo)記Pik-C/T擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)分型；其中，1:華占；2:粵豐新占；3:H4聚合系“H436”；4:H4 ；5:航恢1173 ；6:華占/H4聚合系、7?8:粵豐新占/H4聚合系。
[0021]圖3為功能標(biāo)記Pik-C/T聯(lián)合全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果；其中M:DNA ladder ；I ?2、4、6、9、11:C/C 純合型;3、5、7-8、10、12:C/T 雜合型。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0023]實(shí)施例1水稻基因功能性標(biāo)記Pik-C/T的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增片段分析
1、引物設(shè)計(jì)
以已克隆的抗性復(fù)等位基因Pik-_ L0C_0sllg46210進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在抗性復(fù)等位基因與日本晴pik.2173位堿基處存在SNP變異，其中抗性基因?yàn)門，而感病基因?yàn)镃。設(shè)計(jì)涵蓋差異位點(diǎn)的功能標(biāo)記Pik-C/T。所述的Pik-C/T由4個(gè)引物Pik-T-F、Pik-C-R、Pik-O-F 和 Pik-O-R 構(gòu)成，引物序列(5，_3，)如下:
Pik-T-F:TCTCCGTGAGGTGCATCTCAAAGTTCGTPik-C-R:AACTTGGTTATTGCTTCTGCCCCAGCGPik-O-F: GCAATGCCAGCACTCGAAATCATTGAAAP i k-O-R: TGATAGAGGGGCAGCATCAGATGATTGG
(引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯(cuò)配堿基，加框的堿基為要檢測(cè)的變異堿基)
2、擴(kuò)增片段分析
抗病等位基因(T/T純合型)、感病等位基因(C/C純合型)和雜合型(C/T雜合型)，都能利用Pik-O-F和Pik-O-R擴(kuò)增出大小約為260 bp的條帶，此帶可以用于PCR擴(kuò)增與否的監(jiān)測(cè)。此外，抗病等位基因(T/T純合型)還能利用Pik-T-F和Pik-O-R擴(kuò)增出一條184 bp的條帶；感病等位基因(C/C純合型)能利用Pik-O-F和Pik-C-R擴(kuò)增出一條131 bp的條帶；雜合型(C/T雜合型)既能擴(kuò)增出184 bp的條帶又能擴(kuò)增出131 bp的條帶。
[0024]實(shí)施例2水稻基因功能性標(biāo)記Pik-C/T鑒定7個(gè)水稻的抗病基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以7個(gè)水稻品種為材料:華占、粵豐新占、H4聚合系“H436”、H4、航恢1173、華占/H4聚合系、粵豐新占/H4聚合系。選取水稻單株嫩葉，采用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下:(