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Flotillin-2作為篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)及其應(yīng)用

文檔序號:8468709閱讀:618來源:國知局
Flotillin-2作為篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因和蛋白的功能與應(yīng)用領(lǐng)域,涉及Flotillin-2的新用途,特別是 涉及Flotillin-2作為篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在上皮發(fā)生的腫瘤組織中,腫瘤細(xì)胞通常尚具有上皮組織的細(xì)胞極性,并且細(xì) 胞之間被緊密的細(xì)胞間連接所束縛。當(dāng)上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchamal transition,EMT)時(shí),細(xì)胞逐漸失去典型上皮細(xì)胞的諸多特征,并獲得間葉細(xì)胞的部分特 性,引起后續(xù)一系列腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移事件。這一過程被一系列的細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)信號 分子控制。轉(zhuǎn)化生長因子0 (transforming growth factor-13 )是一種細(xì)胞外生長因子, 已被證明能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,例如通過激活一些非受體類酪氨酸激酶,如Src,啟 動EMT,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。然而,TGF-0所引起的EMT以及Src在此過程所起的作用在鼻咽癌 這一高發(fā)于中國東南部的癌癥中研宄較少。此過程的詳細(xì)機(jī)制在鼻咽癌中尚不明確。
[0003] 平面脂閥是富含膽固醇和鞘磷脂的細(xì)胞膜表面微結(jié)構(gòu)域,與多種細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi) 信號傳導(dǎo)相關(guān)。Flotillin-2 (簡稱Flot2)是細(xì)胞膜上平面脂閥的重要組成蛋白,主要分布 于細(xì)胞膜的胞質(zhì)面或是某些內(nèi)吞囊泡的表面。最近,有研宄證實(shí)Flot2與中性粒細(xì)胞的細(xì) 胞骨架形成及細(xì)胞的迀移能力有關(guān)。過表達(dá)Flot2將低致癌性與低轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤細(xì)胞 系SB2轉(zhuǎn)變成了高致癌性與高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞。此外,沉默F(xiàn)lot2在乳腺癌細(xì)胞中可導(dǎo)致 平面脂閥的完全缺失,降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率。近來有研宄提示,F(xiàn)lot2在神經(jīng)細(xì)胞中參與到 Src激酶的激活過程中,而Src激酶已被證明是TGF-0促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的重要下游信號。然 而,關(guān)于Flot2促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不十分明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)。
[0005] 在本發(fā)明中,發(fā)明人對181例鼻咽癌患者的石賭組織標(biāo)本進(jìn)行Flotillin-2表 達(dá)量進(jìn)行評估,并在功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中對Flotillin-2的促轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行驗(yàn)證。最后,針對 Flotillin-2在調(diào)控TGF-0相關(guān)EMT信號通路的分子機(jī)制進(jìn)行研宄。綜合有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明,F(xiàn)lotillin-2的表達(dá)水平與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān),參與TGF-0入胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是其機(jī)制之一。 因而確定所述的篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)是Flotillin-2。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供Flotillin-2的新應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所述的新應(yīng)用是以Flotillin-2作為藥物靶標(biāo)在篩選抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的 藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明還提供了以Flotillin-2為靶標(biāo)的抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的藥物。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明所述的藥物的進(jìn)一步特征,所述藥物是Flotillin-2的siRNA。
[0010] 本發(fā)明的創(chuàng)新性在于:首次揭示了在鼻咽癌中Flotillin-2 (Flot2)與TGF-0信 號通路的關(guān)系以及二者在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中所起的作用。在本研宄中,總共納入了 181例鼻 咽癌患者,結(jié)果顯示,F(xiàn)lot2在鼻咽癌組織中的表達(dá)量與鼻咽癌患者的轉(zhuǎn)移分期呈正相關(guān)。 Flot2的表達(dá)量是鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo),F(xiàn)lot2高表達(dá)預(yù)示患者通常有較短的 總生存時(shí)間。在鼻咽癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,沉默F(xiàn)lot2可逆轉(zhuǎn)TGF-0的促轉(zhuǎn)移效應(yīng)及TGF-0所引 起的Src激活。隨著Flot2的沉默,可發(fā)現(xiàn),被TGF-0所抑制的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)量上升;而在TGF-0刺激下表達(dá)量升高的間葉細(xì)胞標(biāo)志物vimentin及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子 |3-catenin表達(dá)量則有明顯降低??偟膩碚f,F(xiàn)lot2在鼻咽癌中是患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù) 測因子;是TGF-0信號通路的重要組成部分,是其促進(jìn)EMT的過程中不可或缺的重要節(jié)點(diǎn)。 因此,可以認(rèn)為,沉默F(xiàn)lot2有可能成為對抗TGF-0所引起EMT的重要手段之一。因此,本 發(fā)明為研宄抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011] 圖1A是鼻咽癌組織及癌旁組織免疫組化染色代表圖(放大倍數(shù):200倍)。
[0012] 圖1B是將患者按?M分期分組后不同組別中陰性、弱陽性、強(qiáng)陽性Flot2表達(dá)水 平頻數(shù)示意圖。
[0013] 圖1C是在不同?M組別中Flot2的均數(shù)示意圖。
[0014] 圖2A至圖2C是對鼻咽癌患者的預(yù)后分析的Kaplan-Meier曲線圖,分別依照(A) N分期,(B)M分期,(C) TW總分期進(jìn)行分組。
[0015] 圖2D至圖2F是Flot2的不同表達(dá)水平對鼻咽癌患者預(yù)后的影響的Kaplan-Meier 曲線圖,分析的患者范圍分別為(D)全體入組患者,(E)I-III期患者,(F) IV期患者。
[0016] 圖3A顯示TGF-0在CNE-1細(xì)胞系中誘發(fā)細(xì)胞分散生長并發(fā)生形態(tài)變化(標(biāo)尺長 度:50 y m)〇
[0017]圖3B是使用TGF-0、SB431542、PP2處理鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖。左 側(cè)為代表圖,右側(cè)為定量圖。
[0018]圖3C是使用TGF-0、SB431542、PP2處理鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 圖。
[0019] 圖 3D 是 E-cadherin、vimentin、0-catenin、總 Src 及 p-Src (Tyr416)的 Western blot代表圖以及半定量圖(#P〈0. 01,+P〈0. 001)。
[0020] 圖4A是劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖,顯示TGF- 0誘發(fā)EMT未對Flot2表達(dá)造成影響。
[0021] 圖4B是在不同濃度的TGF-0刺激下的Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖。
[0022] 圖 4C 是 Western blot 代表圖以及半定量圖(*P〈0. 05,#P〈0. 01,+P〈0. 001),顯示 E_cadherin、vimentin、0-catenin、p_Src(Tyr416)的表達(dá)量與 TGF-0 呈現(xiàn)濃度依賴關(guān) 系,但總Src及Flot2表達(dá)量未見明顯變化。
[0023] 圖5A是PCR驗(yàn)證3條Flot2沉默序列的沉默效率的結(jié)果圖。
[0024] 圖5B至圖?顯示CNE-1細(xì)胞的迀移能力未收Flot2沉默的影響。其中,圖5B顯 示細(xì)胞形態(tài),標(biāo)尺=50 ym ;圖5C是劃痕實(shí)驗(yàn);圖ro是Transwell實(shí)驗(yàn)。
[0025] 圖 5E 是 Western blot 代表圖以及半定量圖(#P〈0. 01,+P〈0. 001),顯示 Flot2 沉 默未影響EMT標(biāo)志物E_cadherin,vimentin及0 -catenin表達(dá)。TGF-0受體和總Src表 達(dá)量也未見變化。
[0026] 圖6A顯示TGF-0所引起的CNE-1細(xì)胞形態(tài)改變被Flot2沉默逆轉(zhuǎn)(標(biāo)尺= 50 y m)〇
[0027] 圖6B是劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,圖6C是Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,這兩圖顯示了 Flot2沉 默對TGF- 0刺激細(xì)胞迀移能力的影響。
[0028] 圖6D顯示TGF- 0引起的EMT標(biāo)志物以及Src磷酸化水平的變化被Flot2沉默所 逆轉(zhuǎn)。
[0029] 圖6E是CNE-1細(xì)胞免疫熒光染色圖,顯示了 E-cadherin、vimentin表達(dá)量隨 TGF-0 及 Flot2 沉默而變化的趨勢(#P〈0. 01,+P〈0. 001)。
[0030] 圖7是對本實(shí)驗(yàn)的總結(jié)圖。Flot2對TGF-0信號通路中Src磷酸化是不可缺少的 節(jié)點(diǎn)。沉默F(xiàn)lot2通過降低Src活性逆轉(zhuǎn)TGF- 0在鼻咽癌細(xì)胞中誘發(fā)的EMT。通過此種機(jī) 制,E-cadherin表達(dá)量升高,vimentin及0 -catenin表達(dá)量下降。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 材料和方法
[0032] 患者及腫瘤組織標(biāo)本
[0033] 本發(fā)明所涉及的所有實(shí)驗(yàn)是在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會的許可下進(jìn)行 的,所有的腫瘤組織標(biāo)本取材都經(jīng)過了患者同意。石蠟包埋標(biāo)本是通過手術(shù)切除或電子鼻 咽鏡從181例鼻咽癌患者中獲得的,取材時(shí)間從2004年至2008年。所有納入的患者均依 照nCC/AJCC 1997標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分級。所有患者在取材前均未接受過任何抗腫瘤治療。
[0034] 免疫組化染色
[0035] 免疫組化的具體步驟可參照了發(fā)明人此前所發(fā)表的文章(Lin L,Huang H,Liao W, Ma H,Liu J, Wang L,Huang N and Liao Y. MACClsupports human gastric cancer growth under metabolic stress by enhancing the Warburg effect. Oncogene. 2014) ? 在此不做過多贅述。
[0036] 兔多克隆抗Flot2抗體購自Abeam公司(San Francisco,CA,美國),HRP標(biāo)記二 抗及DAB染色試劑盒購自CWBI0公司。
[0037] 染色深度共分為0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(黃色)、3分
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