單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析 檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 脊柱裂（spina bifida，SB)是由于胚胎發(fā)育過程中椎管閉合不全而引起的一組出 生缺陷性疾病。根據(jù)病變部位有無明顯體征，把脊柱裂分為隱性脊柱裂和顯性脊柱裂兩類， 隱性脊柱裂指只有椎管的缺損而無椎管內(nèi)容物的膨出，病變較隱蔽，一般無需特殊治療；顯 性脊柱裂指棘突及椎板有不同程度的缺如，椎管向背側(cè)開放，好發(fā)于腰骶部。目前較普遍的 觀點(diǎn)認(rèn)為脊柱裂是一種由多因素引起的畸形，包括遺傳和環(huán)境因素及兩者的相互作用。近 年來，模式動(dòng)物研宄表明平面細(xì)胞極性（planar cell polarity，PCP)信號(hào)通路在胚胎神 經(jīng)胚形成過程的匯聚延伸（convergent extension，CE)運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，且已證實(shí) PCP信號(hào)通路核心基因的突變可引發(fā)脊柱裂。對(duì)不同人群進(jìn)行的初步研宄也表明PCP信號(hào) 通路基因與人類脊柱裂的發(fā)生密切相關(guān)，且在不同的種族和國(guó)家之間，發(fā)病率存在差異。
[0003] PCP核心基因之一的VANGL基因，在人類中分別有VANGL1和VANGL2基因，兩 者都落在1號(hào)染色體上，分布于著絲粒的兩端（VANGL1位于lpll-pl3. 1，VANGL2位于 Iq22-q23)，VANGL1基因全長(zhǎng)56Kb，編碼524個(gè)氨基酸；VANGL2基因全長(zhǎng)28Kb，編碼521個(gè) 氨基酸。VANGL蛋白屬于高度保守的膜蛋白，N-端有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C-端在細(xì)胞質(zhì)面，含 有一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)分子相互作用有關(guān)。研宄結(jié)果 顯示在原腸胚和神經(jīng)胚發(fā)育過程中，如果VANGL基因受到干擾，會(huì)導(dǎo)致高度組織特異性的 上皮結(jié)構(gòu)失去正常的極性，從而有可能導(dǎo)致不同程度脊柱裂的發(fā)生。
[0004] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。研宄SNP有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病的易感性。本發(fā)明研宄 應(yīng)用病例-對(duì)照的研宄方法，能夠獲知VANGL1基因rs4839469多態(tài)性與中國(guó)北方漢族兒童 脊柱裂易感性的關(guān)聯(lián)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感 性方法中的應(yīng)用，所述rs4839469位點(diǎn)為VANGL1基因的位點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用。
[0008] 而且，所述rs4839469為VANGL1基因多態(tài)性位點(diǎn)。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0010] 本發(fā)明將等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-對(duì)照組間的頻率分 布具有顯著差異（P值分別為〇. 030和0. 021)，顯示VANGL1基因是中國(guó)北方漢族人群脊柱 裂的易感基因。新發(fā)現(xiàn)的等位基因C的OR值為5. 840 (1. 282-26. 599)，基因型GC的OR值 為6. 399 (1. 387-29. 530)，顯示等位基因C、基因型GC是中國(guó)北方漢族人群脊柱裂發(fā)病的 易感因素。GC基因型，即mRNA序列G -C，導(dǎo)致第116個(gè)氨基酸由丙氨酸（Ala)-脯氨酸 (Pro)〇
【附圖說明】
[0011] 圖1為rs4839469位點(diǎn)基因型GC測(cè)序圖；
[0012] 圖2為rs4839469位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的全序列圖。
[0013] 具體的實(shí)施方式
[0014] 為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實(shí)施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] -種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用，本發(fā)明 為證實(shí)該應(yīng)用，進(jìn)行以下分析和鑒定，具體過程如下：
[0016] -、研宄對(duì)象
[0017] 162例脊柱裂患兒為2003年11月至2013年10月天津市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科收治 的患兒，結(jié)合患兒癥狀、體征、影像學(xué)資料及手術(shù)所見做出診斷。入組病例為長(zhǎng)期居住在中 國(guó)華北、西北及東北地區(qū)的漢族家庭。正常對(duì)照組（162例兒童）也來自天津市兒童醫(yī)院， 排除脊柱裂、先天性心臟病、智力低下等出生缺陷和重大疾病。病例組和對(duì)照組的樣本采集 均獲得天津市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。
[0018] 二、基因組DNA提取與鑒定
[0019] 分別取患兒及對(duì)照組血液2mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用TIANamp Blood DNAKit (北京 天根公司）提取基因組DNA，操作按試劑盒說明進(jìn)行，步驟如下：
[0020] ①取全血200 y 1，加入20 y 1蛋白酶K溶液，混勻后加入200 y 1緩沖液GB，充分 顛倒混勻，于56°C放置10min，其間顛倒混勻數(shù)次，至溶液徹底清亮為止；
[0021] ②加人200 y 1無水乙醇，充分混勻。將溶液加入一個(gè)吸附柱CB3中，12000rpm離 心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；
[0022] ③向吸附柱CB3中加入500 y 1緩沖液⑶（加過無水乙醇），12000rpm離心30sec， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0023] ④向吸附柱CB3中加入600 y 1漂洗液PW(加過無水乙醇），12000rpm離心30sec， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0024] ⑤重復(fù)以上步驟；
[0025] ⑥12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾 干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0026] ⑦將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 y 1 洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。
[0027] 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度與純度。鑒定結(jié)束后，將可用的DNA分裝、標(biāo)記， 部分置于_20°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，其余長(zhǎng)期保存的置于-80°C冰箱。
[0028] 三、PCR 反應(yīng)
[0029] 采用Primer進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0030] F:5,-CAGCCAAACAGACAGAAAG-3，
[0031] R:5'-AGGTCCCTATGAGCAGAAT-3'
[0032] PCR反應(yīng)體系為：10XEx Taq緩沖液2.5yl，dNTP 2yl，正反義引物各0.3yl，模 板 DNA2 y 1，Ex Taq 0? 2 y 1，水 17. 7 y 1。
[0033] 反應(yīng)條件：94 °C 預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)（94 °C 40s，56 °C 40s，72 °C 40s)， 72°C lOmin，12°C保存。目的基因片段分別長(zhǎng)約549bp。
[0034] 四、PCR產(chǎn)物純化
[0035] 按照Millipore公司96純化板規(guī)范操作流程操作。具體操作程序如下：向PCR產(chǎn) 物孔中加入100 U 1重蒸水（ddH20)，取出全部液體至96純化板中室溫靜置10分鐘，以真空 抽濾泵抽10分鐘至抽干，向96孔純化板中加入50 y 1 ddH20,室溫溶解10分鐘，取出對(duì)應(yīng) 的孔中的純化產(chǎn)物至另一 96孔PCR板中。
[0036] 五、測(cè)序反應(yīng)
[0037] 測(cè)序反應(yīng)體系共 5 y 1 :DNA 3 y 1 (30-50ng)，Primer (3pM) 1 y 1，Bigdye 0? 5 y 1， ddH20 0. 5 y 1。測(cè)序反應(yīng)條件：95 °C變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為 95 °C 15s，50 °C 15s，60 °C 90s，35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置12 °C保溫。分析出測(cè)序圖譜 (ABI3730XL 型 DNA 測(cè)序儀）。
[0038] 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0039] Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)樣本是否符合孟德爾遺傳規(guī)律，所用軟件為 hwe(http://www. biology, ualberta. ca/jbrzusto/hwenj. html)。SNP 分型數(shù)據(jù)輸入 SPSS 17. 0軟件，病例-對(duì)照組間等位基因和基因型分布的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fi sher精確 檢驗(yàn)，P〈0. 05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以優(yōu)勢(shì)比（OR)及95%可信區(qū)間（CI)表示各基因型發(fā)生 頻率在不同比較組間的相對(duì)危險(xiǎn)度。
[0040] 七、結(jié)果
[0041] rs4839469(c. 346G>A p. Alall6Thr)位點(diǎn)在測(cè)序?qū)嶒?yàn)中病例組成功157例，對(duì)照 組成功158例，其余由于測(cè)序結(jié)果低質(zhì)量剔除。該位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0. 05,見表1)。該位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族人群中除檢測(cè)出等位基因G、A，還發(fā)現(xiàn)了等 位基因C(基因型GC測(cè)序圖見圖1)。
[0042] 等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-對(duì)照組間的頻率分布具有 顯著差異（P值分別為〇. 030和0. 021)，顯示VANGL1基因是中國(guó)北方漢族人群脊柱裂的 易感基因。新發(fā)現(xiàn)的等位基因C的OR值為5. 840(1. 282-26. 599)，基因型GC的OR值為 6. 399 (1. 387-29. 530)，顯示等位基因C、基因型GC是中國(guó)北方漢族人群脊柱裂發(fā)病的易感 因素。GC基因型，即mRNA序列G - C，導(dǎo)致第116個(gè)氨基酸由丙氨酸（Ala)-脯氨酸（Pro)。
[0043] 表1兩組樣本Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)結(jié)果
[0044]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中 的應(yīng)用，其特征在于：所述rs4839469為VANGLl基因多態(tài)性位點(diǎn)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性rs4839469在分析檢測(cè)脊柱裂易感性方法中的應(yīng)用，所述rs4839469為VANGLl基因多態(tài)性位點(diǎn)，VANGLl基因rs4839469位點(diǎn)的基因多態(tài)性與脊柱裂的發(fā)生密切相關(guān)。本發(fā)明首次在中國(guó)北方漢族人群中發(fā)現(xiàn)rs4839469位點(diǎn)存在等位基因C，且等位基因G、C、A以及基因型GG、GA、GC、AA，在病例-對(duì)照組間的頻率分布具有顯著差異(P值分別為0.030和0.021)，顯示VANGL1基因是中國(guó)北方漢族人群脊柱裂的易感基因。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104789665
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510155506
【發(fā)明人】蔡春泉, 石鷗燕, 王春祥, 王東隨, 沈永明, 王旖旎
【申請(qǐng)人】天津市兒童醫(yī)院
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日