一種基于高分辨率溶解曲線技術進行對蝦性別鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學技術中的對蝦性別鑒定技術，具體地說，是一種簡便高效 的運用分子生物技術實現(xiàn)對蝦性別鑒定的方法，是一種基于高分辨率溶解曲線（HRM)技術 進行對蝦性別鑒定的方法。
【背景技術】
[0002] 對蝦是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖動物，其在我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有舉足輕重的作 用，近十多年來，由于凡納濱對蝦具有生長快、適應力強等特點，凡納濱對蝦已經(jīng)成為了我 國乃至世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的對蝦品種，占我國對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%以上（農(nóng)業(yè)部漁業(yè) 局，2011. 2011年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，129)。
[0003] 凡納濱對蝦的雌雄個體由于激素分泌的不同，成體個體差異較大，培育全雌化 群體是一種高效提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的技術（Li，S.，F(xiàn). Li，Y. Xie，B. Wang, R. Wen, C. Zhang, K. Yu and J. Xiang.''Screening of Genes Specifically Expressed in Males of Fenneropenaeus chinensis and Their Potential as Sex Markers. "Journal of Marine Biology，2013, 1-9.)。在培育全雌化群體的過程中，需要對對蝦的遺傳性別進行分子鑒定， 另外在科學研宄中，對于某些缺少表型性狀的材料如肌肉組織、附肢等也需要進行來源個 體的性別鑒定，在這些情況下均需要用到分子鑒定的手段。
[0004] 高分辨率溶解曲線（HRM)是一種進行快速準確的進行基因分型的技術，該技術是 依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)對PCR產(chǎn)物進行逐漸地解鏈變性，并實時收集檢測該過程中熒光 強度的變化。熒光強度隨著溫度變化，會繪制成一條溶解曲線。由于不同的DNA序列會 形成不同的熔解曲線形狀，因此可以對不同的DNA序列進行區(qū)分（王家豐長牡蠣基因區(qū) SNP標記規(guī)模開發(fā)及其在遺傳育種研宄中的應用博士，中國科學院研宄生院（海洋研宄 所），2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于高分辨率溶解曲線（HRM)技術進行對蝦性別進行 鑒定的方法，為實現(xiàn)對蝦性別低成本、高效率的鑒定提供技術支持。
[0006] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的方案為：
[0007] 提取對蝦的基因組DNA，使用進行性別鑒定的高分辨率溶解曲線（HRM)引物進行 PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線分析，根據(jù)分析結(jié)果獲得雌雄性別的鑒定結(jié)果。
[0008] 所述的對蝦基因組DNA提取方法采用天根植物基因組提取試劑盒中的說明書進 行。
[0009] 進行PCR擴增的引物序列為：
[0010] LvSDHF ：AAATCAGTAAACCCCGAGGG
[0011] LvSDHR ：GCRGTTTCGTTTGCATTTTC〇
[0012] 采用提取的DNA和上述引物進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應的總體積為 20 y L，擴增反應體系為：脫氧核苷酸混合物（lOmmol/L) 0. 4 y L，lOx Taq DNA聚合酶緩沖液 2 y L，MgCl2 (2. 5 y mol/L) 1. 6 y L，LvSDHF 和 LvSDHR(10 y mol/L)各 0? 5 y L，基因組 DNA 模 板（50ng/ y L) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（2. 5U/ y L) 0? 5 y L，雙蒸水補足 20 y L。PCR 反應程序 為 95°C預變性 lOmin，擴增 30 個循環(huán)（95°C 20sec，55°C 30sec，72°C 30sec)，最后 72°C延伸 10min〇
[0013] 擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線（HRM)分析，步驟如下：
[0014] 首先在每個反應管中加入內(nèi)標和飽和染料LC-green各lul，3000轉(zhuǎn)離心30秒。然 后將上述產(chǎn)物放在在PCR儀上95°C變性10min，之后取出冷卻至室溫備用。
[0015] 將PCR產(chǎn)物放入LightScanner96基因分型儀或其他HRM分型儀器中，運行高分辨 率熔解曲線程序，軟件設定為收集55°C -95°C之間的數(shù)據(jù)，升溫速率為0. 1°C /S。程序結(jié)束 后使用自帶的分析溶解曲線查看軟件進行分析。
[0016] 雌雄性別的鑒定：分析軟件給出的溶解曲線，如果溶解曲線與附圖la相同，除了 主峰外，還有一個平滑的副峰（平滑的副峰處于主峰之前），則分析的個體為雜合子，判定 為雌性個體；如果溶解曲線與附圖lb相同，僅有一個主峰，則分析個體為純合子，判定為雄 性個體。
[0017] 該方法的優(yōu)點：
[0018] 簡單：PCR擴增之后可以直接加入熒光染料即可分析獲得結(jié)果，整個過程完全在 一個管中進行，可以避免交叉污染。
[0019] 高效：HRM分析過程僅需要5分鐘，可以同時對96個樣本進行分析，鑒定效率非常 尚。
[0020] 高效：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費用遠少于測序方法。
[0021] 本發(fā)明通過高分辨率溶解曲線（HRM)技術分析對蝦雌雄差異的序列，成功構(gòu)建了 一套簡便高效進行凡納濱對蝦性別鑒定的方法，利用該方法不受對蝦發(fā)育時期、個體大小 等因素的限制，即使很少量的組織即可進行鑒定，并且由于HRM的結(jié)果以溶解曲線的方法 呈現(xiàn)，不同的峰形代表不同的序列特征，因此可以直觀的判斷結(jié)果，可以實現(xiàn)快速高效的鑒 另IJ。本發(fā)明方法是一種簡便、準確的性別鑒定方法，整個分析過程只需要3個小時即可，適 合進行大量個體高效的性別鑒定。該方法在對蝦性別早期的鑒別中具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :高分辨率溶解曲線（HRM)分析結(jié)果；其中：la的結(jié)果對應的個體為雌性個 體，lb對應的個體為雄性個體。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1 :一種基于高分辨率溶解曲線（HRM)技術進行對蝦性別鑒定的方法
[0024] 具體步驟如下：
[0025] 1.從本地選育親蝦、正大親蝦、SIS親蝦、科納灣親蝦中隨機各選擇10尾
[0026] 雌蝦和10尾雄蝦作為實驗組，共計雌蝦40尾，雄蝦40尾。
[0027] 2.使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取上述樣品的DNA并標記，操
[0028] 作方法參考設計和說明書。提取的DNA使用NanodroplOOO(Thermol)測定
[0029] DNA 濃度。
[0030] 3.將提取的DNA使用如下引物進行PCR擴增：
[0031] LvSDHF ；AAATCAGTAAACCCCGAGGG
[0032] LvSDHR ：GCRGTTTCGTTTGCATTTTC
[0033] 其中的PCR擴增反應的總體積為20 yL，擴增反應體系為：脫氧核苷酸混合物 (10mmol/L) 0? 4 y L，lOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2 y L，MgCl2 (2. 5 y mol/L) 1. 6 y L，LvSDHF 和 LvSDHR(10 y mol/L)各 0? 5 y L，基因組 DNA 模板（50ng/ y L) 1 y L，Taq DNA 聚合酶 (2. 5U/ y L) 0. 5 y L，雙蒸水補足20 y L。PCR反應程序為95°C預變性10min，30個擴增循環(huán) (%°C 2〇sec，55°C 3〇sec，72°C 3〇sec)最后 72°C延伸 10min〇
[0034] 4.使用Lightscanner96對擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線（HRM)分析，步
[0035] 驟如下：
[0036] 首先在每個反應管中加入內(nèi)標和飽和染料LC-green各lul，3000轉(zhuǎn)離心30秒。然 后將上述產(chǎn)物放在在PCR儀上95°C變性10min，之后取出冷卻至室溫備用。
[0037] 開機運行Lightscanner96,首先預熱儀器使機器達到工作狀態(tài)，將PCR產(chǎn)物放入 儀器，運行高分辨率熔解曲線程序，軟件設定為收集55°C -95°C之間的數(shù)據(jù)，升溫速率為 0. 1°C /S。程序結(jié)束后使用lightSCanner96自帶的分析軟件進行分析，獲得溶解曲線結(jié)果。
[0038] 5.分析40尾雌蝦和40尾雄蝦的溶解曲線，結(jié)果顯示，所有40尾雌蝦曲線
[0039] 與附圖la相同；所有的雄蝦溶解曲線與附圖lb相同。
[0040] 實施例2 :-種基于高分辨率溶解曲線（HRM)技術進行對蝦性別鑒定的方法
[0041] 具體步驟如下：
[0042] 1.對待進行性別鑒定的20個體進行取樣并做標記。
[0043] 2.使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取上述樣品的DNA并標記，操作方法參 考設計和說明書。提取的DNA使用NanodroplOOO (Thermol)測定DNA濃度。
[0044] 3.將提取的DNA使用如下引物進行PCR擴增：
[0045] LvSDHF ；AAATCAGTAAACCCCGAGGG
[0046] LvSDHR ：GCRGTTTCGTTTGCATTTTC
[0047] 其中的PCR擴增反應的總體積為20 yL，擴增反應體系為：脫氧核苷酸混合物 (10mmol/L) 0? 4 y L，lOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2 y L，MgCl2 (2. 5 y mol/L) 1. 6 y L，LvSDHF 和 LvSDHR(10ymol/L)各 0.5yL，基因組 DNA 模板（50ng/yL)lyL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/ yL)0. 5yL，雙蒸水補足20yL。PCR反應程序為95°C預變性10min，擴增30個循環(huán) (%°C 2〇sec，55°C 3〇sec，72°C 3〇sec)最后 72°C延伸 10min〇
[0048] 4.使用Lightscanner96對擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線（HRM)分析，步驟如 下：
[0049] 每個反應管中加入內(nèi)標和飽和染料LC-green各lul，3000轉(zhuǎn)離心30秒。然后將 上述產(chǎn)物放在在PCR儀上95°C變性10min，之后取出冷卻至室溫備用。
[0050] Lightscanner96,首先預熱儀器使機器達到工作狀態(tài)，將PCR產(chǎn)物放入儀器，運行 高分辨率熔解曲線程序，軟件設定為收集55°C _95°C之間的數(shù)據(jù)，升溫速率為0. 1°C /S。程 序結(jié)束后使用lightscanner96自帶的分析軟件進行分析，獲得溶解曲線。
[0051] 5.對溶解曲線進行分析，發(fā)現(xiàn)共有10尾蝦的溶解曲線與圖la相同，鑒定為雌性個 體，另外10尾溶解曲線與lb相同，鑒定為雄性個體。
【主權(quán)項】
1. 一種基于高分辨率溶解曲線技術進行對蝦性別鑒定的方法，其特征是：首先提取所 需性別鑒定的對蝦個體的基因組DNA，利用進行性別鑒定的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進 行高分辨率溶解曲線（HRM)分析，最終完成對蝦的性別鑒定。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述的進行性別鑒定的高分辨率溶解曲線 分析引物為： LvSDHF：AAATCAGTAAACCCCGAGGG LvSDHR：GCRGTTTCGTTTGCATTTTC〇
3. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線（HRM) 分析：如果分析輸出的溶解曲線除了具有一個主峰外，還有一個平滑的副峰，則該個體記為 雜合子，為雌性個體；如果分析輸出的溶解曲線的結(jié)果僅有一個主峰，則該個體為純合子， 為雄性個體。
4. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述對蝦為凡納濱對蝦。
5. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：所述的高分辨率溶解曲線（HRM)分析，所用 的分析儀器為LightScanner96基因分型儀（Idaho,美國）或者其他可以進行HRM分析的基 因分型儀。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物技術，是一種基于高分辨率溶解曲線(HRM)技術進行凡納濱對蝦遺傳性別鑒定的方法。通過提取對蝦個體的基因組DNA，利用特異性引物對進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行高分辨率溶解曲線分析，根據(jù)分析結(jié)果獲得雌雄性別的鑒定結(jié)果。本發(fā)明方法是一種簡便、準確的性別鑒定方法，整個分析過程只需要3個小時即可，適合進行大量個體高效的性別鑒定。該方法在對蝦性別早期的鑒別中具有廣闊的應用前景。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104789693
【申請?zhí)枴緾N201510247154
【發(fā)明人】于洋, 李富花, 張曉軍, 相建海
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月14日