藻藍(lán)蛋白的提取和穩(wěn)定化方法以及其應(yīng)用
【專利說明】藻藍(lán)蛋白的提取和穩(wěn)定化方法以及其應(yīng)用
[0001]本發(fā)明的目標(biāo)在于藻藍(lán)蛋白的提取和穩(wěn)定化方法，以及其尤其在診斷中和在醫(yī)學(xué)、食品或美容學(xué)領(lǐng)域中或者作為食品補(bǔ)充劑的應(yīng)用。
[0002]藻藍(lán)蛋白是一種水溶性蛋白質(zhì)，其是藍(lán)細(xì)菌例如螺旋藻(鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)或極大螺旋藻(Spirulina maxima))或 AFA(水華束絲藻(Aphanizomenon Flos-Aquae))的主要色素之一。在靜止時，藻藍(lán)蛋白具有藍(lán)顏色并且它被賦予了紅色焚光。它在620nm處具有最大吸收并且在635nm處具有發(fā)射福射。該性質(zhì)使得其成為一種為在生物醫(yī)學(xué)診斷中的優(yōu)異的標(biāo)記物的天然熒光產(chǎn)物。
[0003]在生理學(xué)方面，藻藍(lán)蛋白也是一種重要的抗氧化劑，尤其是用于保護(hù)血漿蛋白免于氧化修飾。藻藍(lán)蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有與膽紅素(其是血紅蛋白的降解產(chǎn)物)非常接近的結(jié)構(gòu)相似性和相當(dāng)近似的特性。
[0004]藻藍(lán)蛋白是一種具有很大好處的分子，尤其是由于其對于人和動物健康有益的特性。藻藍(lán)蛋白尤其因其抗氧化特性和還因其促進(jìn)干細(xì)胞產(chǎn)生的能力而被消費(fèi)。
[0005]然而，它是一種昂貴且難以提取的分子。此外，它是一種在細(xì)菌污染的情況下在提取后非?？斓亟到獾姆肿樱@抬高了成本，因?yàn)橐砸后w形式，在水中，該分子應(yīng)當(dāng)在無菌條件下進(jìn)行提取并且包裝成單劑量。
[0006]已經(jīng)提出了各種不同的提取方法，其中包括切向流過濾、加速溶劑提取、細(xì)胞裂解和兩相水提取。
[0007]專利FR 2 789 399描述了在0.2微米下的切向流過濾方法，其使得能夠在水性介質(zhì)中以冷的狀態(tài)且無菌地提取藻藍(lán)蛋白。然而，該方法需要重大投資，因?yàn)榍邢蛄鬟^濾設(shè)備是非常昂貴的，并且它意味著單劑量包裝，例如玻璃安瓿瓶，因?yàn)樵诖蜷_后該介質(zhì)就不再是無菌的并且藻藍(lán)蛋白在這些條件下不能保存在水中。
[0008]在用甘油代替水作為溶劑的情況下，該方法非常難以施行，因?yàn)楦视途哂袑τ谠试S在良好的條件下施行切向流過濾來說過大的粘度。
[0009]持續(xù)少于三十分鐘的加速溶劑提取方法的特征為維持溶劑處于其沸點(diǎn)之下的高的溫度和壓力。在該方法中，測試了各種不同的溶劑:己烷、石油醚、乙醇和水，在60、115和170°C的溫度下以及3、9和15分鐘的各種不同提取時間。所有這些溶劑都存在問題:己烷和石油醚是有毒的。乙醇允許最有效的提取，但存在許多問題；毒性、在某些宗教中的禁律和比用己烷或石油醚(其具有非常低的提取產(chǎn)率，對于己烷僅為4.30%，和對于石油醚僅為3.60% )大得多的抗氧化活性的喪失。至于水，存在保存的問題，因?yàn)樵诩?xì)菌污染的情況下，藻藍(lán)蛋白在幾天內(nèi)就降解了。
[0010]最經(jīng)常使用的細(xì)胞裂解技術(shù)涉及下述的冷凍-解凍階段的交替:
[0011].要么，超聲處理，其使細(xì)胞膜破裂并因此有助于接近存在于細(xì)胞質(zhì)和胞內(nèi)細(xì)胞器中的分子；
[0012].要么，在冷凍-解凍步驟期間添加pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，然后通過攪拌器，隨后為用鹽酸進(jìn)行提取的步驟。
[0013]然后，通過離心步驟來進(jìn)行各種不同組分的分開和濃縮，所述離心步驟使得能夠收集其中存在有藻藍(lán)蛋白的上清液。
[0014]該技術(shù)具有缺點(diǎn)，這是由于以水性形式的藻藍(lán)蛋白在細(xì)菌污染的情況下迅速降解并因此應(yīng)當(dāng)以無菌形式或以冷的(冷凍)狀態(tài)進(jìn)行保存，這引起重大的額外費(fèi)用。
[0015]兩相水提取牽涉分子在兩個或更多個不混溶的水相之間的分開。向給定量的新鮮的藻藍(lán)蛋白提取物添加聚乙二醇(PEG)和磷酸鉀。在混合和傾析后，該系統(tǒng)分開成兩個相。然后，通過離子交換色譜法和UV光譜學(xué)來分析這些相以評估藻藍(lán)蛋白和總蛋白質(zhì)的純度和量。使用PEG和磷酸鉀的混合物來實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白與其他蛋白質(zhì)之間的分配系數(shù)。然后，使該系統(tǒng)經(jīng)歷兩相水提取。為了增加純度，進(jìn)行離子交換色譜法。盡管該提取方法使得能夠獲得良好的藻藍(lán)蛋白濃度，但是它具有需要許多且復(fù)雜的步驟和需要使用尖端且昂貴的設(shè)備這樣的缺點(diǎn)。
[0016]因此，對于易于實(shí)施且經(jīng)濟(jì)上令人滿意的用于獲得藻藍(lán)蛋白的方法存在需要。
[0017]一個額外的要求涉及所獲得的藻藍(lán)蛋白溶液的穩(wěn)定性。這是因?yàn)?，已知在水性介質(zhì)中，通過熱或紫外線來進(jìn)行的滅菌降解藻藍(lán)蛋白分子并且在包裝打開后喪失全部效力，這意味著單劑量包裝?；瘜W(xué)防腐劑具有毒性，這使得它們對于食品用途來說是不相容的。只有用精油來進(jìn)行的試驗(yàn)給出了可接受的結(jié)果。羅文莎(樟樹(Cinnamomum Camphora))的精油延遲了細(xì)菌成長，同時保持與食品用途相容，但是該處理僅適合于藻藍(lán)蛋白的短期儲存，因?yàn)榧?xì)菌成長被減慢但未被消滅。同樣也不可能使介質(zhì)強(qiáng)烈地酸化以阻止細(xì)菌的成長，因?yàn)樵逅{(lán)蛋白對于PH非常敏感并且任何重大變化都引起分子發(fā)生沉淀。藻藍(lán)蛋白在pH 5以下和pH 7.5以上變得不穩(wěn)定并且發(fā)生沉淀。
[0018]冷凍是一種簡單實(shí)施的解決辦法，但是它使得運(yùn)輸非常復(fù)雜且非常昂貴，因?yàn)樾枰３掷滏湣?br>[0019]高濃度的酒精(乙醇)允許使藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定化，但是改變了藻藍(lán)蛋白的特性，藻藍(lán)蛋白喪失很大部分的其抗氧化特性。此外，由于它所服從的多種宗教禁律，酒精是有問題的。此外，它的使用面臨許多技術(shù)問題:它是非常易燃的、具有依賴性(酒精毒性)的產(chǎn)品，對其施加商業(yè)約束，從而摻有酒精的產(chǎn)品要服從許多稅和禁律。
[0020]在提取過程期間所使用的其他溶劑或化學(xué)產(chǎn)品:己烷、石油醚、磷酸鹽緩沖溶液、聚乙二醇，是昂貴的并且具有重大的食物毒性問題。
[0021]用于允許在環(huán)境溫度下長期保存藻藍(lán)蛋白的由工業(yè)家找到的解決辦法為下述:
[0022].要么，在提取和濃縮后將藻藍(lán)蛋白以脫水干粉末的形式進(jìn)行保存，這大大地降低了其效力，因?yàn)楦稍锔淖兞朔肿右约捌淙S結(jié)構(gòu)并且導(dǎo)致該分子的生物學(xué)特性和熒光特性的喪失或降低；
[0023].要么，將藻藍(lán)蛋白以在水性介質(zhì)中的液體形式進(jìn)行保存，這意味著昂貴且復(fù)雜的提取、澄清和無菌過濾過程，隨后為包裝成單劑量(例如玻璃安瓿瓶)，因?yàn)樵诖蜷_后，介質(zhì)被細(xì)菌污染并因此應(yīng)當(dāng)立即消費(fèi)。
[0024]知曉液體形式是具有優(yōu)先特權(quán)的，其中以該形式的藻藍(lán)蛋白具有比以干的形式高得多的生物利用率，因?yàn)樗蕴幱谔烊恍问讲⑶冶Ａ袅似錈晒馓匦浴?br>[0025]這些方法大大地抬高了價格，并且使得具有活性且高度純化的藻藍(lán)蛋白非常昂貴。其價格可以達(dá)到50US$/毫克經(jīng)純化的蛋白。
[0026]因此，以可達(dá)到的成本并且在其特性沒有降級的情形下生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白仍是一個挑戰(zhàn)。
[0027]由發(fā)明人所進(jìn)行的研宄顯示，通過施行用新的溶劑進(jìn)行提取的步驟，這些問題可以令人滿意地得到克服。
[0028]因此，本發(fā)明的目的在于提供藻藍(lán)蛋白的提取和穩(wěn)定化的新方法。
[0029]本發(fā)明還旨在提供藻藍(lán)蛋白溶液或提取物，其在需要時具有其他營養(yǎng)物，具有大的穩(wěn)定性，有利地可以以多劑量包裝使用，以用于特別地在診斷中和在醫(yī)學(xué)、食品或美容學(xué)領(lǐng)域中或者作為食品補(bǔ)充劑的應(yīng)用。
[0030]從至少一種包含藻藍(lán)蛋白的材料中提取藻藍(lán)蛋白的方法的特征在于，所述方法包括將所述材料浸漬在甘油或“水/甘油”混合物中的步驟。
[0031 ] “水/甘油”混合物的使用具有更低的成本、更快的過濾、產(chǎn)品的流動性更高這樣的好處，并且允許具有更好效力的提取。當(dāng)使用“水/甘油”混合物代替純甘油時，在濾液中藻藍(lán)蛋白的含量更高。
[0032]有利地，“水/甘油”比例可以直至60/40。
[0033]甘油是一種具有許多優(yōu)點(diǎn)的分子。甘油是經(jīng)批準(zhǔn)的食品成分(E422)，其被認(rèn)為是非常安全的并因此被允許適量使用。甘油是伊斯蘭教律法的合法食物、合猶太教規(guī)的清潔食物，并且可被素食主義者和純素食主義者消費(fèi)。最后，甘油有著具有令人愉快的甜味和是低熱的這樣的優(yōu)點(diǎn)。此外，它是由活生物體天然產(chǎn)生的分子。當(dāng)身體使用儲備的脂肪作為能量來源時，甘油和脂肪酸