L-哌啶甲酸的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及氨基酸的分離方法，具體涉及一種L-哌啶甲酸的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-哌啶甲酸又名L-高脯氨酸，是L-賴氨酸的衍生物，可作為醫(yī)藥中間體或生物尼 龍的生產(chǎn)前體。目前，國(guó)內(nèi)外L-哌啶甲酸的生產(chǎn)多采用化學(xué)合成、光催化和生物催化方式。 生物催化過(guò)程溫和，且產(chǎn)物專一，極具應(yīng)用潛力。日本Mercian制藥公司利用重組氨轉(zhuǎn)移酶 LAT和同類的P5C還原酶將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-哌啶酸。盡管如此，生物法獲得的L-哌 啶甲酸的分離純化，國(guó)內(nèi)卻尚無(wú)報(bào)道。
[0003] 氨基酸類物質(zhì)的樹(shù)脂分離常用的是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。D103-MTBE催化樹(shù)脂目前被 用于合成甲基叔丁基醚（MTBE)，甲基叔戊基醚（TAME)，輕汽油醚化的催化劑，以及某些以 強(qiáng)酸為催化劑和有機(jī)反應(yīng)，以及作為催化劑載體等。目前還沒(méi)有關(guān)于將D103-MTBE催化樹(shù) 脂用于類似L-哌啶甲酸發(fā)酵液這類生物制品分離的相關(guān)專利和報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種L-哌啶甲酸的分離方法，該方法簡(jiǎn)單方便、能耗低，可大幅度 降低下游分離純化成本。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種L-哌啶甲酸的分離方法，將含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化樹(shù)脂，樹(shù)脂吸附飽 和后，以堿性溶液作為洗脫劑對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液結(jié)晶、干燥得到L-哌 啶甲酸。
[0006] 含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化樹(shù)脂的流速為0. 4~3 mL/min。
[0007] 所述催化樹(shù)脂為D103-MTBE催化樹(shù)脂。
[0008] 所述催化樹(shù)脂為WS-3催化樹(shù)脂。
[0009] 催化樹(shù)脂填充量為每克濕樹(shù)脂吸附0. 1-0. 2 g L-哌啶甲酸。
[0010] 所述堿性溶液為〇· 05-0. 1% (v/v)的氨水。
[0011] 含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化樹(shù)脂的流速優(yōu)選為lmL/min。
[0012] 所述堿性溶液優(yōu)選體積濃度為0. 1%的氨水。
[0013] 本發(fā)明所述的結(jié)晶和干燥的方法可以為本領(lǐng)域公知的各種方法，包括但不限于溶 劑蒸發(fā)、真空蒸發(fā)、低壓真空干燥等。
[0014] 發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)D103-MTBE或者WS-3催化樹(shù)脂能夠高效分離L-哌啶甲酸， 并且待分離液中可以包含磷酸鹽、L-賴氨酸等雜質(zhì)。所述待分離液可以為微生物發(fā)酵生產(chǎn) L-哌啶甲酸所得的混合液，也可以為其他合成途徑所得。本發(fā)明提供的分離方法，適用于將 L-哌啶甲酸與某些理化特性與其相似的化合物例如磷酸鹽、L-賴氨酸等分開(kāi)，在樹(shù)脂吸附 洗脫之前可以先對(duì)待分離溶液做適當(dāng)去雜處理，比如過(guò)濾。
[0015] 由于本發(fā)明采用的是樹(shù)脂吸附-洗脫來(lái)將L-哌啶甲酸與某些理化特性與其相似 的化合物分開(kāi)，因此本發(fā)明對(duì)所述含L-哌啶甲酸的待分離液中的L-哌啶甲酸濃度沒(méi)有特 別限定。一般地優(yōu)選待分離液中含有的L-哌啶甲酸濃度為5-30 g/L，pH值為7. 0-8.0。
[0016] 有益效果： 本發(fā)明提供的L-哌啶甲酸的分離方法，簡(jiǎn)單方便、能耗低，分離得到的L-哌啶甲酸純 度高，收率高。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為L(zhǎng)-哌啶甲酸、L-賴氨酸含量分析的高效液相色譜圖譜，圖中，出峰時(shí)間 2. 720 min、3. 105min的物質(zhì)為磷酸鹽(磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀)，出峰時(shí)間為5. 273 min的 物質(zhì)為L(zhǎng)-賴氨酸、出峰時(shí)間為19. KMmin的物質(zhì)為L(zhǎng)-哌啶甲酸。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0019] L-哌啶甲酸溶液的制備 用發(fā)酵法制備：發(fā)酵底物為L(zhǎng)-賴氨酸25 g/L，用50mM磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液） 調(diào)整發(fā)酵液pH為7. 0-8.0。培養(yǎng)方法：將重組五co/iBL21(DE3) (Hanxiao Ying，Jing Wang, Zhen Wang, Jiao Feng，Kequan Chen, Yan Li, Ouyang Pingkai. Enhanced conversion of L-Iysine to L-pipecolic acid using a recombinant Escherichia coli containing lysine cyclodeaminase as whole-cell biocatalyst[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2015， http://dx.doi.Org/doi:10.1016/ 」.111〇1〇3吐.2015.05.001)接入種子培養(yǎng)基(胰蛋白胨1(^/1，酵母提取物58/1，他(：11(^/ L，用ImM NaOH溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH為7.0-8. 0)，在37 °C、200 rpm下培養(yǎng)18小時(shí)。20%的 接種量接入IL發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，400 rpm、37 °C下培養(yǎng)48小時(shí)。放罐時(shí)，L-哌啶 甲酸的產(chǎn)量是10-20 g/L，然后將發(fā)酵液通過(guò)分子量50 KDa的超濾膜去掉菌體和大部分蛋 白質(zhì)，得到的溶液作為以下實(shí)施例中進(jìn)行L-哌啶甲酸分離的待分離液。
[0020] L-哌啶甲酸和L-賴氨酸的濃度是通過(guò)美國(guó)Alltech 1500型高效液相色譜儀檢 測(cè)。檢測(cè)條件為屮代￥&11(：18色譜柱（250\4.6_，1.(1.5 4111);柱溫：30°〇；流動(dòng)相： 0. 4% (v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0. 5ml/min ;檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD);檢測(cè)器 溫度：120 °C ;載氣：氮?dú)?純度99. 9%);載氣流速：4 L/min ;進(jìn)樣體積：10 yL。
[0021] L-哌啶甲酸純度為L(zhǎng)-哌啶甲酸在結(jié)晶、干燥所得固形物中的質(zhì)量百分比。
[0022] L-哌啶甲酸收率為結(jié)晶、干燥后所得L-哌啶甲酸與初始待分離L-哌啶甲酸的質(zhì) 量百分比。
[0023] 實(shí)施例1 本實(shí)施例對(duì)上述發(fā)酵法制備得到的含L-哌啶甲酸的發(fā)酵液作進(jìn)一步分離提純，含 L-哌啶甲酸的發(fā)酵液中L-哌啶甲酸10 g/L，L-賴氨酸2 g/L，磷酸鹽50 mM。
[0024] 用35 g D103-MTBE催化樹(shù)脂填充固定床，平衡后將含L-哌啶甲酸的待分離液上 柱，流速0. 4 mL/min，400 mL后吸附飽和，然后用0. 05% (v/v)氨水進(jìn)行洗脫，洗脫液體積 為688 mL，經(jīng)HPLC測(cè)定洗脫液中L-哌啶甲酸濃度為5. 54 g/L。結(jié)晶、干燥后L-哌啶甲酸 產(chǎn)品純度97. 8%，收率95. 4%。
[0025] 實(shí)施例2 本實(shí)施例對(duì)上述發(fā)酵法制備得到的含L-哌啶甲酸的發(fā)酵液作進(jìn)一步分離提純，含 L-哌啶甲酸的發(fā)酵液中L-哌啶甲酸30 g/L，L-賴氨酸5 g/L，磷酸鹽20 mM。
[0026] 用200 gD103-MTBE催化樹(shù)脂填充固定床，平衡后將含L-哌啶甲酸的待分離液上 柱，流速I mL/min，550 ml后吸附飽和，然后用0.1% (v/v)氨水進(jìn)行洗脫，洗脫液體積為 800 ml，經(jīng)HPLC測(cè)定洗脫液中L-哌啶甲酸濃度為13. 66 g/L，結(jié)晶、干燥后L-哌啶甲酸產(chǎn) 品純度98. 2%，收率99. 1%。
[0027] 實(shí)施例3 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的分離L-哌啶甲酸的方法。
[0028] 本實(shí)施例對(duì)上述發(fā)酵法制備得到的含L-哌啶甲酸的發(fā)酵液作進(jìn)一步分離提純， 含L-哌啶甲酸的發(fā)酵液中L-哌啶甲酸5 g/L，L-賴氨酸15 g/L，磷酸鹽100 mM。
[0029] 用15 gD103-MTBE催化樹(shù)脂填充固定床，平衡后將含L-哌啶甲酸的待分離液上 柱，流速3 ml/min，420 ml后吸附飽和，然后用0.08% (v/v)氨水進(jìn)行洗脫，洗脫液體積為 730 ml，經(jīng)HPLC測(cè)定洗脫液中L-哌啶甲酸濃度為1. 94 g/L，結(jié)晶、干燥后L-哌啶甲酸產(chǎn)品 純度98. 5%，收率98. 6%。
[0030] 實(shí)施例4 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的分離L-哌啶甲酸的方法與常規(guī)氨基酸分離方法的比 較。
[0031] 分別用25 gD103-MTBE催化樹(shù)脂、WS-3催化樹(shù)脂、WA-3氨基酸專用樹(shù)脂、DOOl陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂、D113陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、D002陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，填充固定床，平衡后將800 mL 濃度為14 g/L的L-哌啶甲酸溶液上柱，流速I mL/min，吸附飽和后，然后用0. 1% (v/v)氨 水進(jìn)行洗脫，結(jié)晶、干燥后測(cè)定L-哌啶甲酸的純度和收率，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0032]表 1 :
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：將含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化 樹(shù)脂，樹(shù)脂吸附飽和后，以堿性溶液作為洗脫劑對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液結(jié) 晶、干燥得到L-哌啶甲酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：含L-哌啶甲酸的待 分離液通過(guò)催化樹(shù)脂的流速為0. 4~3 mL/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：所述催化樹(shù)脂為 D103-MTBE催化樹(shù)脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：所述催化樹(shù)脂為WS-3 催化樹(shù)脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：催化樹(shù)脂填充量為每 克濕樹(shù)脂吸附0. 1-0. 2 g L-哌啶甲酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：所述堿性溶液為 0? 05-0. 1% (v/v)的氨水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：所述含L-哌啶甲酸 的待分離液中含有的L-哌啶甲酸濃度為5-30 g/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：含L-哌啶甲酸的待 分離液通過(guò)催化樹(shù)脂的流速為lmL/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的L-哌啶甲酸的分離方法，其特征在于：所述堿性溶液為0. 1% (v/v)的氨水。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種L-哌啶甲酸的分離方法，將含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化樹(shù)脂，樹(shù)脂吸附飽和后，以堿性溶液作為洗脫劑對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液結(jié)晶、干燥得到L-哌啶甲酸。含L-哌啶甲酸的待分離液通過(guò)催化樹(shù)脂的流速為0.4~3mL/min。所述催化樹(shù)脂為D103-MTBE或者WS-3催化樹(shù)脂。催化樹(shù)脂填充量為每克濕樹(shù)脂吸附0.1-0.2gL-哌啶甲酸。所述堿性溶液為0.05-0.1%（v/v）的氨水。該方法簡(jiǎn)單、方便，節(jié)約生產(chǎn)成本。
【IPC分類】C07D211-60
【公開(kāi)號(hào)】CN104803909
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510268919
【發(fā)明人】陳可泉, 何珣, 葉峰, 黃慧, 錢娟, 歐陽(yáng)平凱
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年5月25日