步驟：
[0031] (31)于稱量瓶中，將辣根過(guò)氧化物酶5p毫克溶于0. 3mol/L、PH8. 1的碳酸氫鈉溶 液Ip毫升中，加入1%二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液0.1 p毫升，25°C攪拌Ih ;p為大于零的比 例系數(shù)；
[0032] (32)加入0· 08mol/L過(guò)碘酸鈉溶液Ip毫升，25°C攪拌30min，溶液呈黃綠色；
[0033] (33)加0. 08mol/L乙二醇溶液Ip毫升，25°C攪拌1小時(shí)，然后將稱量瓶中液體裝 入透析袋中；
[0034] (34)用0· 01mol/L、pH 9. 5碳酸緩沖液1000 p毫升，進(jìn)行4°C透析12h，換液3次， 取出透析袋中液體加入稱量瓶中；
[0035] (35)將5p毫克所述兔抗IgY抗體溶于0· 01mol/L pH 9. 5碳酸鈉緩沖液Ip毫升 中，然后加入稱量瓶中，室溫輕攪2~3h，25°C攪拌2~3小時(shí)；
[0036] (36)于稱量瓶中，加入硼氫化鈉（NaBH4) 5p毫克，置4°C放置3h以上；
[0037] (37)稱量瓶中，逐滴加入等量飽和硫酸銨溶液4 °C放置Ih，以4000rpm離心 15min，棄上清液，沉淀再用50 %飽和硫酸銨洗2次；
[0038] (38)沉淀溶于200p微升的0. 01mol/L、pH7. 4的PBS液中，裝入透析袋并以 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS液作為透析液充分透析至無(wú) NH4+，再4°C、1000 rpm離心10min去沉 淀，取上清液，得酶標(biāo)記抗體。
[0039] 經(jīng)測(cè)試，本發(fā)明制備出的酶標(biāo)記抗體IgG-HRP可以適用各種卵黃抗體鑒定，效價(jià) 檢測(cè)的通用試劑。因此，本發(fā)明能為卵黃抗體檢測(cè)提供選擇，為各種卵黃抗體的應(yīng)用價(jià)值提 供依據(jù)。
[0040] 本發(fā)明還將上述酶標(biāo)記抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例一
[0042] 本實(shí)施例提供的一種兔抗IgY抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0043] (1)硫酸銨鹽析法粗提取IgG :
[0044] (101)取等體積量的兔抗IgY免疫血清和生理鹽水進(jìn)行混合，邊攪拌邊滴加飽和 硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度為50%，記錄此時(shí)飽和硫酸銨的加入量X毫升，X>0,4°C靜 置3h以上，3000rpm離心20min，棄上清液，得沉淀物；
[0045] 在通常的一次操作中，等體積量為10毫升?？梢愿鶕?jù)實(shí)際情況進(jìn)行取值，不限于 取10 _升。
[0046] (102)將沉淀物用生理鹽水稀釋至0. 5X毫升，邊攪拌邊滴加飽和硫酸銨，使溶液 中硫酸銨飽和度為33%，4°C靜置3h以上，3000rpm離心20min，棄上清液，取沉淀物；然后 重復(fù)此步驟2次，即用沉淀物按照步驟（102)得第一次的沉淀物，然后又用第一次的沉淀物 按照步驟（102)得第二次的沉淀物。所述第二次的沉淀物為步驟（102)所需制備的產(chǎn)物。
[0047] (103)按每毫克沉淀物加500ul的生理鹽水的比例用生理鹽水溶解（102)所制得 的沉淀物，裝入透析袋，置4°C用0. lmol/L、PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液（PBS)作為透析處 理液進(jìn)行透析除鹽，更換透析處理液數(shù)次直至：奈氏試劑測(cè)定無(wú) NH4+(有NH4+會(huì)出現(xiàn)磚紅色 或黃色），1 % BaClJ〗定無(wú) SO廣（有S0,會(huì)出現(xiàn)白色沉淀）；得所需的IgG樣品，置4°C保 存；
[0048] 為了更好地掌握實(shí)驗(yàn)，通常會(huì)對(duì)IgG樣品進(jìn)行測(cè)定蛋白含量。
[0049] 測(cè)定蛋白含量計(jì)算方法是：
[0050] IgG 樣品蛋白含量（mg/ml) = (1. 45 X OD28tl- 0· 74X OD2J X 稀釋倍數(shù)。
[0051] 其中，為了使得酶標(biāo)記抗體的良好制備，IgG樣品的性能最好滿足：IgG抗體效價(jià) 測(cè)定雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)蘭1:16, ELISA試驗(yàn)蘭1:8000。
[0052] (2)葡聚糖凝膠純化IgG :
[0053] (201)凝膠的預(yù)處理：交聯(lián)葡聚糖凝膠（sephadex)商品多為干燥顆粒，使用前必 須充分溶脹。方法是，取sephadex G-100凝膠緩慢地傾倒入5~10倍體積的去離子水中， 加熱煮沸進(jìn)行凝膠溶脹；此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排 除氣泡；
[0054] (202)裝柱：凝膠床總體積與樣品的加入量應(yīng)滿足：樣品的加入量（體積）應(yīng)掌握 在凝膠床總體積的5%~10% ;
[0055] 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定；純化蛋白質(zhì)時(shí)，樣品 的加入量（體積）應(yīng)掌握在凝膠床總體積的5%~10%。凝膠層析柱的裝填要求：凝膠層 析柱要求柱中的填料（凝膠）密度均勻一致，不能有空隙和氣泡；通常新裝的凝膠柱用適當(dāng) 的緩沖溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖-2000、細(xì)胞色素帶血紅蛋白等物質(zhì)配制成質(zhì)量濃 度為2g/L的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則， 必須重新裝填；
[0056] (203)加樣：凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流 出口，用滴管加入樣品，打開流出口，使樣品緩慢滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表 面持平時(shí)，用洗脫液沖洗管壁；
[0057] 其中，加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。采用280nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，一根 2cmX60cm的柱，加樣量需5mg左右。加樣量越少或加樣體積越?。悠窛舛雀撸?，分辨率 越高。通常樣品的加入量（體積）應(yīng)掌握在凝膠床總體積的5%~10%。樣品體積過(guò)大， 分離效果不好。
[0058] (204)洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)（通常包括層析床、洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè) 儀、分部收集器及記錄儀），調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升，進(jìn)行洗脫，收集洗脫液中與目 的峰相應(yīng)的部分洗脫液作為所需的兔抗IgY抗體。
[0059] 對(duì)于目的峰的確認(rèn)，可以先收取各個(gè)階段的峰，然后分別做電泳進(jìn)行鑒定來(lái)選擇 目的峰。這可由本技術(shù)領(lǐng)域人員按常規(guī)技術(shù)完成。確定目的峰后，可以結(jié)合層析譜圖得出 與目的峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間段，從而進(jìn)行收集與目的峰相應(yīng)的部分洗脫液。
[0060] 在葡聚糖凝膠純化IgG的過(guò)程中，一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液， 有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫時(shí)用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。若無(wú)此裝置，可用控 制操作壓的辦法進(jìn)行。洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分 離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0. 02~0.1 Mol/L、pH 6· 9 ~8· 0 的 PBS 液（0· 14Mol/L NaCl)或 0· lMol/L、pH8. OTris-HCl 緩沖鹽溶液（0· 14Mol/ L NaCl)〇
[0061] 其中一個(gè)實(shí)施例中，上述步驟（101)中兔抗IgY免疫血清的制備方法，包括以下步 驟：
[0062] (111) IgY制備：取一個(gè)雞蛋并用清水沖洗，用剪刀打開蛋殼一個(gè)小孔，讓蛋清緩 慢流出，然后打開蛋殼，小心將整個(gè)卵黃移出；雞蛋卵黃加入8倍體積的滅菌的雙蒸水，用 濃度為0.1 M的HCl溶液調(diào)PH為5. 0-5. 1，置4°C冰箱攪拌8h，得卵黃稀釋液；冰箱取出卵 黃稀釋液，以10000-12000rpm、4°C進(jìn)行離心15min，收取上清液；于上清液（上清液為水 溶性組分液WSF)中加入使用0. 01mol/L、PH7. 4的PBS液配制的濃度為8%的PEG6000量 (PEG，英文名全稱polyethylene glycol，中文名為聚乙二醇），雞蛋卵黃（g)/濃度為8%的 PEG6000 量（ml) = 5,攪拌 30min，以 10000-12000rpm、4°C進(jìn)行離心 10min，收集沉淀，去上 清液；將沉淀物溶于濃度為0. 01mol/L、pH7. 4的PBS液并裝入透析袋中，在透析液（濃度為 0. 01mol/L，PH值為7. 4的PBS液）中透析，每毫克沉淀物對(duì)應(yīng)500 μ 1的PBS液、500ml的 透析液；透析完成后用〇. 22 μ m膜過(guò)濾除菌，取蛋白質(zhì)濃度大于30mg蛋白/ml的產(chǎn)物作為 所需的IgY，置_20°C保存；
[0063] 所得到的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量。
[0064] (112) IgY免疫原制備：將所制備的IgY用PBS液進(jìn)行稀釋至蛋白質(zhì)濃度30mg蛋 白/ml，將IOml弗氏完全佐劑置于研缽內(nèi)，邊研磨邊滴加等量所稀釋后的IgY，直至形成白 色油包水乳劑，（滴加于水中完全不散開即為合格），置4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0065] (113)免疫家兔：選用2~2. 5kg健康家兔，于頸后，兩后肢大腿外側(cè)共四個(gè)部 位皮下各注射步驟（112)所得物0. 5ml，7天后再次同樣免疫，21天后同樣部位注射步驟 (111)所得物〇. 5ml，末次注射后第7天試血，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)達(dá)1 : 16~1 : 32 放血收集血清，得兔抗IgY免疫血清。
[0066] 其中一個(gè)實(shí)施例中，弗氏完全佐劑的制備方法如下：稱取羊脂8F克，量取石臘油 32F毫升，F(xiàn)>0,置高壓滅菌器滅菌后用無(wú)菌研缽研磨均勻，置4°C冰箱過(guò)夜，12h后仍均勻 粘稠無(wú)分層，即為弗氏不完全佐劑；將其