長效多肽及其生產(chǎn)和施用方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明是申請日為2007年2月5日，申請?zhí)枮?00780012026. 6,標(biāo)題為"長效多 肽及其生產(chǎn)和施用方法"的專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明提供包括至少兩個與感興趣的肽連接的絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽 (CPT)的多肽以及編碼所述多肽的多核苷酸。也提供包括本發(fā)明的多肽和多核苷酸的藥物 組合物及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 多肽在血液、肝臟或腎臟中都容易被變性或酶降解。因此，多肽一般都具有短的循 環(huán)半衰期，通常是數(shù)個小時。由于它們的低穩(wěn)定性，通常需要按持續(xù)的頻率來轉(zhuǎn)運肽藥物， 以便保持活性肽的有效的血漿濃度。此外，因為通常需要通過輸注來施用肽藥物，因此頻繁 的注射肽藥物會給對象帶來相當(dāng)多的不適。因此，需要延長藥物性多肽的半衰期同時保持 其高藥物療效的技術(shù)。這種期待中的肽藥物也應(yīng)當(dāng)滿足增強血清穩(wěn)定性、高活性以及當(dāng)被 注射到對象體內(nèi)時誘導(dǎo)不必要的免疫應(yīng)答的低可能性的要求。
[0004] 不利的藥物動力學(xué)例如短半衰期可以妨礙許多其他有希望的藥物候選物的藥物 開發(fā)。血清半衰期是分子的一種經(jīng)驗特征，必須要通過實驗地測定出每種新的潛在藥物的 半衰期。例如，對于低分子量多肽藥物而言，生理清除機制例如腎臟濾過可以使得保持藥物 的治療水平變?yōu)殡y以實現(xiàn)，主要是因為所需給藥方案的價格或頻率。相反地，長的血清半衰 期也是不利的，因為這樣的藥物或其代謝物具有毒性副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括至少兩個與感興趣的多肽序列相連接的絨 毛膜促性腺激素羧基末端肽（CTP)氨基酸序列的多肽。
[0006] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括與感興趣的多肽序列的氨基末端連接的 第一個絨毛膜促性腺激素 CTP氨基酸（AA)序列以及與感興趣的多肽序列的羧基末端連接 的第二個CTP氨基酸序列的多肽。
[0007] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括兩個與感興趣的多肽序列的羧基末端連 接的絨毛膜促性腺激素 CTP序列的多肽。
[0008] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括與感興趣的多肽序列的氨基末端連接的 第一個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及與感興趣的多肽序列的羧基末端連接的第二個 和第三個CTP AA序列的多肽。
[0009] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括至少三個與感興趣的多肽序列相連接的 絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0010] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼多肽的序列的多核苷酸，所述多肽 包括至少兩個與感興趣的多肽序列相連接的絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列。
[0011] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼與感興趣的多肽序列的氨基末端連 接的第一個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及與感興趣的多肽序列的羧基末端連接的第 二個CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0012] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼兩個與感興趣的多肽序列的羧基末 端連接的絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0013] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼與感興趣的多肽序列的氨基末端連 接的第一個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及與感興趣的多肽序列的羧基末端連接的第 二個和第三個CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0014] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼至少三個與感興趣的多肽序列相連 接的絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列的序列的多核苷酸。
[0015] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了治療對象的生長、體重相關(guān)性病變或代謝性 病變的方法，所述方法包括給對象施用治療有效量的CTP-hGH的步驟，據(jù)此治療患有生長 或體重相關(guān)性病變的對象。hGH-般是用于治療生長疾病，特別是生長激素缺乏相關(guān)性疾 病。在我們的實施例中，我們證實了垂體切除小鼠（不再分泌生長激素）在注射CTP-hGH 之后重新得到了生長。
[0016] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了提高感興趣的多肽序列的生物半衰期的方 法，包括將至少兩個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列連接于感興趣的多肽序列的步驟。
[0017] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了給所需治療的對象施用感興趣的多肽序列的 方法，包括將至少兩個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列連接于感興趣的肽系列的步驟。
[0018] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括至少兩個與EPO肽相連接的絨毛膜促性 腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0019] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括與EPO肽的氨基末端連接的第一個絨毛 膜促性腺激素 CTP AA序列以及與EPO肽的羧基末端連接的第二個CTP AA序列的多肽。
[0020] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括兩個與EPO肽的羧基末端相連接的絨毛 膜促性腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0021] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括與EPO肽的氨基末端連接的第一個絨毛 膜促性腺激素 CTP AA序列以及與EPO肽的羧基末端連接的第二個和第三個CTP AA序列的 多肽。
[0022] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括至少三個與EPO肽相連接的絨毛膜促性 腺激素 CTP AA序列的多肽。
[0023] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼至少兩個與EPO肽相連接的絨毛膜 促性腺激素 CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0024] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼與EPO肽的氨基末端連接的第一個 絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及與EPO肽的羧基末端連接的第二個CTP AA序列的核苷 酸序列的多核苷酸。
[0025] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼兩個與感興趣的多肽序列的羧基末 端連接的絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0026] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼與感興趣的多肽序列的氨基末端連 接的第一個絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列以及與感興趣的多肽序列的羧基末端連接的第 二個和第三個CTP AA序列的核苷酸序列的多核苷酸。
[0027] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了包括編碼至少三個與感興趣的多肽序列相連 接的絨毛膜促性腺激素 CTP AA序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
[0028] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了治療或降低對象的貧血發(fā)生率的方法，包括 給對象施用治療有效量的EPO-CTP的步驟，據(jù)此治療患有貧血的對象。
【附圖說明】
[0029] 圖1A-1F是顯示六個EPO-CTP構(gòu)建體的圖。
[0030] 圖IA是多肽SEQ ID NO: 1的圖。
[0031] 圖IB是多肽SEQ ID NO:2的圖。
[0032] 圖IC是多肽SEQ ID NO:3的圖。
[0033] 圖ID是多肽SEQ ID NO:4的圖。
[0034] 圖IE是多肽SEQ ID NO:5的圖。
[0035] 圖IF是多肽SEQ ID NO:6的圖。
[0036] 圖2是顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染的DG44細胞表達EPO-CTP變體的照片。如在"樣品制備"中所 述的制備出來自轉(zhuǎn)染細胞的最終測試樣品，并在SDS-PAGE上跑膠。用免疫印跡檢測蛋白。
[0037] 圖3是顯示重組hEPO衍生物和EP0-3 (SEQ ID N0:3)的體內(nèi)生物學(xué)活性的圖表。 ICR 小鼠（每組7 只）接受每周單次 IV 注射（15yg/kg)EP0-3、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。對照動物IV注射PBS。每周 收集血樣3次，檢測出紅細胞壓積水平。每個點都代表紅細胞壓積的組內(nèi)平均值（％ ) 土 SE。
[0038] 圖4是顯示重組hEPO衍生物和EP0-1(SEQ ID NO: 1)的體內(nèi)生物學(xué)活性的圖表。 ICR 小鼠（每組7 只）接受每周單次 IV 注射（15yg/kg)EP0-l、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。對照動物IV注射PBS。每周 收集血樣3次，檢測出紅細胞壓積水平。每個點都代表紅細胞壓積的組內(nèi)平均值（％ ) 土 SE。
[0039] 圖5是顯示重組hEPO衍生物和EP0-2(SEQ ID NO: 2)的體內(nèi)生物學(xué)活性的圖表。 ICR 小鼠（每組7 只）接受每周單次 IV 注射（15yg/kg)EP0-2、rhEP0-WT(SEQ ID N0:16)、 Recormon (商品化ΕΡ0)或每周3次Recormon (5 μ g/kg)共3周。對照動物IV注射PBS。每周 收集血樣3次，檢測出紅細胞壓積水平。每個點都代表紅細胞壓積的組內(nèi)平均值（％ ) 土 SE。
[0040] 圖 6 是顯示在單次推注劑量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的網(wǎng)織紅細胞水平變化的時距圖。
[0041] 圖 7 是顯示在單次推注劑量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的血紅蛋白水平變化（表示為相對于基線水平的變化）的時距圖。
[0042] 圖 8 是顯示在單次推注劑量 EP〇-〇(SEQ ID N0:16)、EP0-3(SEQ ID N0:3)和 Aranesp之后的紅細胞壓積水平變化（表示為相對于基線水平的變化）的時距圖。
[0043] 圖 9 是顯示 IV 注射后的 EPO-O (SEQ ID NO: 16)、EP0-3 (SEQ ID NO: 3)和 Aranesp 的血清濃度的圖。
[0044] 圖 10 是顯示 M0D-4020(SEQ ID N0:36)、M0D-4021(SEQ ID N0:37)、M0D-4022(SEQ ID NO :38)、M0D-4023 (SEQ ID NO :39)和 M0D-4024 (SEQ ID NO :40)的分子量和身份的免疫 印跡。照片表明與商品化和野生型的hGH -樣，抗hGH抗體可以識別出M0D-7020-4變體。
[0045] 圖11是顯示垂體切除小鼠在施用本發(fā)明的GH-CTP多肽之后的體重增長的條線 圖。
【具體實施方式】
[0046] 在一個實施方式中，本發(fā)明描述了長效多肽以及生產(chǎn)和使用所述多肽的方法。在 一個實施方式中，長效多肽包括人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)。在一個實 施方式中，CTP作為保護劑起到抗蛋白降解或抗源自所述蛋白的肽降解的作用。在一個實 施方式中，CTP延長了蛋白或源自所述蛋白的肽的循環(huán)半衰期。在一個實施方式中，CTP增 強了蛋白或源自蛋白的肽的效力。
[0047] 在另一個實施方式中，"CTP肽"、"羧基末端肽"和"CTP序列"在此可以互換使用。 在另一個實施方式中，羧基末端肽是全長CTP。在另一個實施方式中，羧基末端肽是截短的 CTP。每種可能性都代表著本發(fā)明的獨立的實施方式。
[0048] 在另一個實施方式中，"ΕΡ0肽"和"ΕΡ0序列"在此可以互換使用。在另一個實施 方式中，EPO肽是EPO蛋白。在另一個實施方式中，羧基末端肽是截短的EPO蛋白。每種可 能性都代表著本發(fā)明的獨立的實施方式。
[0049] 在另一個實施方式中，"信號序列"和"信號肽"在此可以互換使用。在另一個實施 方式中，當(dāng)涉及多核苷酸時，"序列"可以指的是編碼部分。每種可能性都代表著本發(fā)明的獨 立的實施方式。
[0050] 在另一個實施方式中，"感興趣的肽"和"感興趣的多肽序列"在此可以互換使用。 在另一個實施方式中，感興趣的肽是全長蛋白。在另一個實施方式中，感興趣的肽是蛋白片 段。每種可能性都代表著本發(fā)明的獨立的實施方式。
[0051] 在一個實施方式中，提供了包括至少兩個與感興趣的多肽序列相連接的絨毛膜促 性腺激素的羧基末端肽（CTP)序列的多肽，其中至少兩個CTP序列中的第一個CTP序列與 感興趣的多肽序列的氨基末端連接以及至少兩個CTP序列中的第二個序列與感興趣的多 肽序列的羧基末端連接。在另一個實施方式中，羧基末端肽（CTP)序列是人絨毛膜促性腺 激素的CTP序列。
[0052] 在另一個實施方式中，羧基末端肽（CTP)經(jīng)連接物與感興趣的多肽序列相連接。 在另一個實施方式中，連接CTP序列和感興趣的多肽序列的連接物是共價鍵。在另一個實 施方式中，連接CTP序列和感興趣的多肽序列的連接物是肽鍵。在另一個實施方式中，連接 CTP序列和感興趣的多肽序列的連接物是取代肽鍵。
[0053] 在另一個實施方式中，術(shù)語"感興趣的多肽序列"指的是任一多肽序列，例如具有 生物學(xué)活性的多肽序列。在另一個實施方式中，肽是糖基化的肽。在另一個實施方式中，肽 是非糖基化的肽。從延長其循環(huán)半衰期中獲益的多肽實例包括但不限于促紅細胞生成素 (EPO)、干擾素、人生長激素（hGH)和胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)。
[0054] 在另一個實施方式中，人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)與蛋白融 合。在另一個實施方式中，人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)與糖蛋白融合。 在另一個實施方式中，人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)與糖蛋白激素融合。 在另一個實施方式中，人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基末端肽（CTP)與源自糖蛋白激素 的肽融合。在一些實施方式中，糖蛋白激素包括EP0、FSH、或TSH以及源自上述激素的肽。
[0055] 在一些實施方式中，多肽的氨基末端以及多肽的羧基末端的CTP序列提供了增強 的抗蛋白降解的保護性。在一些實施方式中，多肽的氨基末端以及多肽的羧基末端的CTP 序列為所連接的蛋白提供了延長的半衰期。
[0056] 在一些實施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至 少一個額外的與羧基末端的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列提供了增強的抗蛋白降解的保護 性。在一些實施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一 個額外的與羧基末端的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列為所連接的蛋白提供了延長的半衰 期。多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一個額外的與羧基末端 的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列為所連接的蛋白提供了增強的活性。
[0057] 在一些實施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至 少一個額外的與氨基末端的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列提供了增強的抗蛋白降解的保護 性。在一些實施方式中，多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一 個額外的與氨基末端的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列為所連接的蛋白提供了延長的半衰 期。多肽的氨基末端的CTP、多肽的羧基末端的CTP序列、以及至少一個額外的與氨基末端 的CTP序列串聯(lián)連接的CTP序列為所連接的蛋白提供了增強的活性。
[0058] 在另一個實施方式中，本發(fā)明的羧基末端肽（CTP)包括如SEQ ID NO: 17所示的來 自人絨毛膜促性腺激素第112到145位氨基酸（AA)的AA序列。在另一個實施方式中，本 發(fā)明的羧基末端肽（CTP)包括如SEQ ID NO: 18所示的來自人絨毛膜促性腺激素的第118 到145位AA的AA序列。在另一個實施方式中，CTP序列也可以開始于人絨毛膜促性腺激 素的第112到118位之間的任一位點以及終止于第145位。在一些實施方式中，CTP序列 肽是 28、29、30、31、32、33、或3444長度并開始于〇^4八序列的第112、113、114、115、116、 117 或 118 位。
[0059] 在另一個實施方式中，CTP肽是絨毛膜促性腺激素 CTP的變體，其與天然CTP有著 1到5個保守AA取代的不同，如美國專利5, 712, 122所述。在另一個實施方式中，CTP肽是 絨毛膜促性腺激素 CTP的變體，其與天然CTP有著1個保守AA取代的不同。在另一個實施 方式中，CTP肽是絨毛膜促性腺激素 CTP的變體，其與天然CTP有著2個保守